枸杞Lb14-3-3b基因的表达分析及转烟草研究

在宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)品种宁杞1号花药发育差异蛋白质组学研究的基础上,克隆了一个花药发育相关基因Lb14-3-3b,证实该基因在花器官中优势表达。本试验进一步利用荧光定量PCR技术分析枸杞Lb14-3-3b基因在花药发育过程中不同时期的表达特征,并通过构建植物过表达载体Lb14-3-3b-pCambia1305. 1-35s,经根瘤农杆菌介导法转化模式植物烟草,探究该基因在植物生长发育中的功能。结果表明,在枸杞花药发育的各个时期,Lb14-3-3b都有表达,在花药二核花粉时期表达量最高。与野生型烟草相比,转Lb14-3-3b基因烟草生长发育迟缓,植株矮小,花器官畸变,花瓣缺少致使花型趋于四角化,雄蕊及花丝数目缺少且发育异常。推测枸杞Lb14-3-3b基因在烟草生长发育及花器官发育中起调控作用,研究结果为进一步探讨该基因在枸杞生长发育中的调控作用提供参考依据。

枸杞Lb14-3-3b基因的克隆及其在不同组织中的表达

在前期枸杞花药发育蛋白质组差异研究的基础上,利用RT-PCR技术,从宁夏枸杞"宁杞1号"花药中克隆出了一个花药发育相关蛋白基因。根据生物学信息分析,该基因属于14-3-3蛋白基因家族,命名为Lb14-3-3b,并对基因序列及其编码的氨基酸序列基本性质进行分析,预测其编码蛋白的二、三级结构。利用基因枪法将融合有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体转入洋葱表皮细胞,分析Lb14-3-3b基因的亚细胞定位。采用q RT-PCR技术分析了Lb14-3-3b基因在枸杞不同组织中的表达,并构建了Lb14-3-3b基因的正、反义表达载体p Cambia1305.1-35s-Lb14-3-3b(+)及pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3b(-)。结果表明:Lb14-3-3b基因的ORF长747 bp,具有14-3-3蛋白家族保守结构域。枸杞Lb14-3-3b与马铃薯、番茄的14-3-3蛋白处于进化树同一分枝上,亲缘关系最近。该蛋白是一个主要由α-螺旋构成的异源二聚体,它的两个亚基形成了一个靶蛋白结合活性中心。Lb14-3-3b亚细胞定位于细胞质中,该基因在枸杞生殖器官中优势表达。成功将Lb14-3-3b基因的ORF插入植物表达载体的CaMV35s启动子后面,并将Lb14-3-3b基因的正、反义表达载体转入农杆菌GV3101中。为进一步探究该基因在枸杞花药发育中的调控机制提供了载体和研究基础。