携带Lipocalin 2基因重组减毒沙门菌的构建及其对分枝杆菌生长影响的研究

目的:探讨携带脂质运载蛋白2(lipocalin 2,Lcn2)的减毒沙门菌对分枝杆菌生长的影响。方法:以巨噬细胞RAW264.7提取RNA逆转录为c DNA为模版,采用PCR法扩增Lcn2基因,定向克隆到质粒pBudCE4.1-orim的多克隆位点中,构建重组质粒pBudCE4.1-orim-Lcn2;将重组质粒转染RAW264.7细胞,用RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA相对表达量,并以空白载体为对照组;将重组质粒转入减毒沙门菌SL7207得到重组菌株SL7207-pBudCE4.1-orim-Lcn2;重组菌感染RAW264.7细胞,Western blot检测Lcn2的蛋白表达,RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA的相对表达量,并以空载菌组为对照;7H10平板上通过菌落计数观察重组菌对感染RAW264.7细胞的卡介苗(Bacille calmette-guerin,BCG)生存的影响,以空载菌组为对照。用重组菌灌胃小鼠,检测脾组织Lcn2和血清IFN-γ水平,以空载菌和生理盐水为对照组。结果:PCR扩增出Lcn2基因;重组质粒经双酶切及基因测序鉴定正确。重组菌感染RAW264.7细胞Lcn2的蛋白表达量较对照组增加(P=0.000)。RT-qPCR法检测重组菌、重组质粒Lcn2 mRNA表达较对照组明显升高(P=0.000,F=5.281;P=0.000,F=22570)。7H10平板上重组菌组BCG数量与空载菌组相比明显减少(P=0.000,F=11.41)。重组菌组与空载对照菌组相比小鼠脾组织Lcn2表达升高(P=0.000,F=4.449),重组菌组与生理盐水组血清IFN-γ升高(P=0.004,F=15.27)。结论:成功构建了携带Lcn2基因的重组减毒沙门菌。重组菌感染RAW264.7细胞后Lcn2的表达增加,对感染RAW264.7的BCG存活起到一定的抑制作用。重组菌灌胃后小鼠脾组织Lcn2表达增加,血清IFN-γ含量增加,小鼠免疫状态有利于结核病转归。该研究为进一步研究脂质运载蛋白和结核分枝杆菌感染的关系及分子机制打下基础。