基于CRISPR/Cas9系统的番茄LeMYB330突变体制作及突变位点分析

植物MYB转录因子在植物防卫反应过程中发挥重要作用,番茄LeMYB330是与根结线虫效应蛋白MiPDCD6互作的靶标蛋白。本研究利用在线软件CRISPR-GE (http://skl.scau.edu.cn/)设计了番茄LeMYB330基因编辑双靶点,在番茄LeMYB330基因第3外显子区域找到彼此相距124 bp的2个靶点,分别为TG1:5’-ATGCAACAGTGGTACAACTGAGG-3’和TG2:5’-GGTGGTCAAGAAGTTGTATGAGG-3’。将靶点T1和靶点T2的sg RNA表达盒进行Golden Gate克隆连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元表达载体,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCas9-MYB330T1T2)。利用农杆菌介导的遗传转化将重组载体转入‘新金丰一号’番茄愈伤组织,经潮霉素抗性筛选获得共计50株CRISPR/Cas9突变番茄植株。番茄转基因后代测序结果表明,有3株阳性植株发生突变,由此成功构建了番茄LeMYB330突变体。试验结果可为加快番茄LeMYB330功能基因资源的开发利用提供有力的理论与方法支持。

番茄myb基因片段的克隆及在过敏性反应时的表达

以烟草myb1中MYB保守区域编码序列的两个相对特异性序列为引物 ,以表现过敏性反应(hypersensitiveresponse,HR)的番茄苗中提取的RNA为模板 ,通过RT -PCR获取长度为 2 15bp的myb基因片段LeMYB1和LeMYB2 (GenBank核酸序列数据库登录号 :AY1312 30和AY1312 31)。两者只有第 6 3位碱基不同 ,前者序列为A ,而后者为G。Northern杂交分析表明 ,LeMYB相关基因表达时序与番茄苗HR的产生和发展呈密切正相关 ,因而可能在Cf