CONSTRUCTION OF Sesbania rostrata COSMID GENOMIC LIBRARY AND MOLECULAR CLONING OF LEGHEMOGLOBIN GENE

Using plant mini-Ti cosmid pEND4K, the cosmid genomic library of Sesbania rostratawas constructed. Sizes of plant DNA inserts in clones were 25- 33 kb. The restrictionmapping showed that different recombinant involved various types of plant DNA insert. 4clones containing leghemoglobin gene sequence of S. rostrata were obtained by in situ hy-bridization of colonies. The cloning of leghemoglobin gene sequence has been confirmedby plasmid DNA dot hybridization and Southern blot hybridization.

大豆血红蛋白基因lba转化根瘤菌工程菌株的构建

以土著大豆根瘤菌接种大豆幼苗45 d后获得的根瘤为材料,提取其总RNA并反转录成cDNA,采用同源序列克隆法扩增大豆血红蛋白基因lba编码区序列。利用DNA重组技术,将lba基因连到lac启动子的下游,利用带有发光酶标记基因luxAB的质粒载体pTR102构建表达载体pTR-Plac-lba。采用三亲本杂交的方式,将表达载体pTR-Plac-lba及作为对照的空载体pTR102分别转化土著大豆根瘤菌,获得根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lba)和SFH(pTR102)。盆栽试验发现,接种SFH(pTR-Plac-lba)的大豆植株各生理指标明显高于接种SFH(pTR102)、土著根瘤菌以及未接菌的大豆植株各生理指标。试验证明,导入大豆血红蛋白基因lba的根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lba)对于提高大豆根瘤的固氮酶活性,增加大豆产量起到显著效果。

大豆血红蛋白串联基因簇转化根瘤菌工程菌株的构建

研究提取大豆根瘤总RNA并将其反转录成cDNA,以其为模板采用同源序列克隆法,利用PCR技术获得大豆血红蛋白基因lbc3、lbc2、lbc1、lba的编码区序列;利用DNA重组技术,将4个血红蛋白基因顺序连接,构建成串联基因簇lbc3-lbc2-lbc1-lba(命名为lbX),并构建了lbX的原核表达载体pTR-Plac-lbX;采用三亲本杂交的方法,将原核表达载体pTR-Plac-lbX转化土著大豆根瘤菌,构建转基因根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lbX),为研究转基因工程菌株对大豆根瘤固氮能力的影响奠定基础。

苜蓿核基因组文库的构建及其实验方法的几点改进

目前,基因文库的构建方法虽已逐步普及,但仍有不少实验因最终未能从构建的文库中钓出目的基因而告失败。其主要原因是构建的文库没有达到预期的要求——真实有效.我们对核 DNA 分离和载体左右臂制备等的常用方法进行了改进,构建了苜蓿的核基因组文库,其容量测定、重组子鉴定及初步的杂交筛选都证明该文库真实有效。苜蓿(Medicago sativa L.)DNA 的制备参照 Shure 等(1983)和 Ausubel

转基因衣藻lba及对照藻产氢培养条件的优化

通过对莱茵衣藻849及其转基因衣藻lba进行光照强度、细胞浓度和培养基中硫酸盐含量三因素三水平的正交实验,确定了两个藻种的最佳产氢条件,同时对转基因藻和849产氢培养条件下的光合放氧速率和pH进行了检测。实验结果表明,在25℃下,莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最佳产氢条件都为光照强度60μmol/(m2.s),细胞浓度为叶绿素含量12.5μg/ml,培养基中硫酸盐含量0μmol/L。莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最高氢气产量分别达到了349μl/mg chlorophyll和634μl/mg chlorophyll。在产氢条件下,转基因藻lba的净光合放氧速率比849低。结果为利用豆血红蛋白特性通过基因工程手段提高莱茵衣藻产氢量提供基础实验数据。