PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备。方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定。结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带。结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.

嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本实验采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增得到军团菌毒力基因(L eg ionellav iru lence gene,lvg A gene),并将其定向连接入克隆载体pUC 18,构建重组质粒pU lvgA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,再将lvgA基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pG lvgA,转化宿主菌JM 109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印记分析鉴定。实验结果表明,成功扩增出627 bp的lvgA基因,构建了重组质粒pU lvgA及原核表达重组质粒pG lvgA,并使53.7 KD a的G ST-lvgA融合蛋白质在原核系统中得到了有效的表达。

应用PCR检测环境水体中的嗜肺军团菌

目的 建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌。 方法 采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测。 结果 该方法检测军团菌的灵敏度为5 .8×10 2 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出65 0bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0 %。 结论 该方法快速、灵敏、特异。

嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究

目的:了解外环境水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征及遗传背景。方法:40株分离株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为LP1型嗜肺军团菌后,利用普通PCR技术对军团菌属5S rRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用实时荧光定量PCR技术扩增嗜肺军团菌mip基因,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics Version 4.0软件进行聚类分析。结果:所有的菌株均带有属特异性5S rRNA基因及mip毒力基因,PFGE聚类分析结果显示大多数菌株的遗传相似度有一定差异。结论:所有菌株经普通PCR或定量PCR均相应扩增出其特征基因,PFGE聚类分析结果提示浙江省散在水系中分离的嗜肺军团菌菌株存在遗传多样性。