构建细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)慢病毒干扰载体,获得有感染性的病毒颗粒,感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞,并检测其对前体脂肪细胞的干扰效率.首先设计并合成3对针对目的基因SOCS3的siRNA序列,退火后...构建细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)慢病毒干扰载体,获得有感染性的病毒颗粒,感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞,并检测其对前体脂肪细胞的干扰效率.首先设计并合成3对针对目的基因SOCS3的siRNA序列,退火后连接于LentiH1上,测序验证后,与包装质粒△8.9和vsv-g共转染到293T细胞中进行包装和浓缩,纯化后测定病毒滴度,然后感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞.重组慢病毒载体LentiH1-siRNA经酶切和测序鉴定正确,病毒滴度为3×107tu/mL,感染猪成肌细胞和前体脂肪细胞后,可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western印迹分析表明,前体脂肪细胞中SOCS3的表达被显著下调,其中LentiH1-siRNA3介导对SOCS3基因mRNA和蛋白的干扰效率分别达53%和71%.本研究成功构建了猪SOCS3慢病毒干扰载体,感染猪前体脂肪细胞能稳定沉默SOCS3基因的表达,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础.展开更多
文摘构建细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)慢病毒干扰载体,获得有感染性的病毒颗粒,感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞,并检测其对前体脂肪细胞的干扰效率.首先设计并合成3对针对目的基因SOCS3的siRNA序列,退火后连接于LentiH1上,测序验证后,与包装质粒△8.9和vsv-g共转染到293T细胞中进行包装和浓缩,纯化后测定病毒滴度,然后感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞.重组慢病毒载体LentiH1-siRNA经酶切和测序鉴定正确,病毒滴度为3×107tu/mL,感染猪成肌细胞和前体脂肪细胞后,可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western印迹分析表明,前体脂肪细胞中SOCS3的表达被显著下调,其中LentiH1-siRNA3介导对SOCS3基因mRNA和蛋白的干扰效率分别达53%和71%.本研究成功构建了猪SOCS3慢病毒干扰载体,感染猪前体脂肪细胞能稳定沉默SOCS3基因的表达,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础.
