油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)侵染条件研究

对采自安徽油菜黑胫病菌分离株的ITS序列进行了测定和分析,结合GenBank中的有性型Leptosphaeriamaculans和Leptosphaeria biglobosa的ITS序列构建了系统发育树,将该病菌鉴定为Leptosphaeria biglobosa。在人工气候条件下,对Leptosphaeria biglobosa侵染条件的研究表明,油菜黑胫病菌是属偏高温高湿类型的病害,在温湿度条件不能得到满足时,病害就难以完成侵染发病;温度与保湿时间对Leptosphaeria biglobosa的侵染有很大的影响,病原菌侵染的最佳温度和保湿时间组合为:温度21～24℃,保湿48 h以上。保湿48 h以下,随着保湿时间的减少及培养温度的降低或升高,病情指数均降低;但在12～72 h各保湿梯度内,随培养温度由15～21℃上升,病情指数逐渐升高,而随培养温度由21～27℃上升,病情指数逐渐降低。

温度对油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)假囊壳和子囊孢子发育的影响

油菜黑胫病是双球小球腔菌(Leptosphaeria biglobosa)引起的一种真菌病害,在油菜产区广泛发生。为了解我国特定气候和栽培条件下的流行规律,通过室内试验和田间试验探讨了温度对罹病油菜茎秆上L.biglobosa假囊壳和子囊孢子发育的影响。室内试验结果表明:在保证环境水分(湿度)充足的条件下,温度影响L.biglobosa假囊壳和子囊孢子的发育进程。在4℃下培养105 d,成熟假囊壳比例仍低于1%,而在10、15、20和25℃下分别培养66.5、57.9、34.5和47.3 d后,成熟假囊壳比例达到50%。可见,10~25℃较4℃更适合L.biglobosa假囊壳和子囊孢子发育。武汉的田间试验结果表明:L.biglobosa越夏后(8月底),在平均气温26℃和平均降雨量为2.7 mm/d的条件下,经过56.3 d成熟假囊壳的比例达到50%。L.biglobosa越秋后(10月底),在平均气温为12℃和平均降雨量为1.5mm/d条件下,仅需28.1 d成熟假囊壳的比例即达到50%。可见秋末冬初的环境条件较夏末秋初更加适合L.biglobosa假囊壳和子囊孢子发育。研究结果还表明:L.biglobosa子囊孢子在水琼脂培养基上培养2 h后(20℃)萌发率达到100%,萌发方式是两端细胞先萌发,中间细胞后萌发,子囊孢子能直接侵染油菜子叶,引起坏死病斑。

油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)T-DNA插入突变体表型特征分析

【目的】鉴定油菜黑胫病菌T-DNA随机插入突变体的表型特征。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化体系获得黑胫病菌突变体,对这些突变体的生物学特性、致病性、胞外酶进行研究。【结果】大部分突变体的菌落形态与野生型菌株无明显差异;突变体生长速度和产孢量均低于野生型菌株,只有1个突变体产孢量显著高于野生型菌株;所测突变体中53%的突变体与野生型菌株相比,致病性无显著差异;有7个突变体致病性显著升高,突变体和野生型菌株均可分泌蛋白酶和淀粉酶,不分泌果胶酶和纤维素酶。【结论】获得了与野生型菌株表型最为相近的突变体T34,为黑胫病菌与寄主互作机制及其致病机制研究奠定了基础。

黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程,利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片,利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果表明,接种油菜叶片7 h后,分生孢子萌发并长出芽管;17 h后,芽管侵入气孔;24 h后,分生孢子全部萌发;36 h后萌发的芽管形成菌丝;120 h后,菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延,并侵入叶肉细胞。13 d后,菌丝侵入茎部皮层组织;15 d后,菌丝在皮层细胞间隙蔓延,并侵染至茎表皮;21 d后,菌丝侵染至维管组织;23 d后,菌丝侵染至茎韧皮部;25 d后,茎导管被侵染,并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa在油菜叶片和茎中的侵染过程,可为油菜与黑胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。

甘肃省大白菜叶斑病菌分离鉴定及生物学特性测定

为明确引起甘肃省大白菜叶斑病的病原,对采自甘肃省陇南市武都区带有明显病斑症状的大白菜叶片采用组织分离法进行分离和致病性测定,结果表明菌株BCG为引起大白菜叶斑病的病原菌。其菌落圆形,中央菌丝褐色,周围菌丝白色绒毛状,分生孢子单细胞,壁光滑,透明,呈梭形或圆柱形;分生孢子器扁平,深褐色,大小204.20μm×140.88μm。利用ITS、Actin和β-tubulin基因序列分析表明,与油菜黑胫病菌(L.biglobosa)的相似性均达到了99%,且在系统发育树上聚在一起,结合形态特征将其鉴定为油菜黑胫病菌(L.biglobosa)。油菜黑胫病菌菌丝生长的最适培养基为PDA,最适生长温度为25℃,最适碳源为L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和木糖,最适氮源为酵母浸粉;孢子萌发的最适温度为20℃,最适碳源为甘露醇,最适氮源为尿素;菌丝生长和孢子萌发的最适宜pH为6.0。该研究结果为国内首次报道由油菜黑胫病菌(L.biglobosa)引起大白菜叶斑病,为大白菜叶斑病的诊断和防治提供依据。

黑胫病菌侵染过程中油菜响应基因的表达分析

油菜黑胫病是造成油菜产量损失的病害之一,致病菌为Leptosphaeria biglobosa。该研究采用形态学观察和转录组测序技术,分析油菜接种病原菌Leptosphaeria biglobosa 4、12、24、36、48和96 h后的表型及基因表达变化情况,以探讨响应死体营养型真菌L.biglobosa侵染时油菜的防御反应及抗病机理,为揭示油菜与L.biglobosa互作的分子机制提供理论依据,并为培育油菜抗病品种积累了基因资源信息。结果显示:(1)接种4~96 h,叶片病斑逐渐扩大,病原菌侵染48~96 h后形成菌丝网。(2)通过RNA-Seq测序,在L.biglobosa侵染油菜的不同时间点(4、12、24、36、48和96 h)分别得到3384、2270、3802、5811、6155和7153个差异表达基因。(3)15个油菜差异表达基因的qRT-PCR检测表达水平与转录组测序结果基本一致。(4)利用短时间序列聚类和KEGG富集分析差异表达基因,结果发现植物病原菌互作、蛋白激酶、茉莉酸/乙烯/水杨酸和芥子油苷合成途径中的基因被强烈诱导表达,而且基因表达呈动态变化趋势。

不同抗性油菜品种接种黑胫病菌防御酶活性变化研究

通过研究油菜体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)含量及活性变化规律与黑胫病侵染过程、品种抗病性的关系,揭示不同油菜品种对黑胫病菌的抗病机制。用紫外分光光度计测定并比较分析抗、感品种接种前后,各种防御酶活性的变化规律。接种前,抗病品种的POD、PPO、CAT活性高于感病品种,PAL、SOD活性则与感病品种相近。接种后抗病品种表现出较高的敏感性,5种防御酶活性均迅速升高而达到峰值,且其酶活性增加量显著大于感病品种;而感病品种防御酶的活性或增幅较小或较抗病品种滞后。黑胫病菌可以诱导油菜体内5种防御酶活性变化,POD、PPO、CAT、PAL、SOD的酶活性与油菜的抗病性具有正相关关系,这些防御酶活性峰值出现的高低与早晚,可作为早期鉴定油菜抗黑胫病的生理指标。

油菜黑胫病研究进展

油菜黑胫病是一种世界性分布的真菌病害,由子囊菌Leptosphaeria biglobosa引起。近年来随着田间调查的深入,及其姊妹病害油菜茎基溃疡病(Leptosphaeria maculans引起)传入风险的增加,我国对油菜黑胫病的重视程度逐年增加。本文对油菜黑胫病病原菌种群、病害循环及危害症状、分布与寄主范围、分子检测技术以及综合防治等方面的研究进展进行了综述,也分析了油菜茎基溃疡病菌对我国的侵入风险,同时对我国油菜黑胫病研究和防控提出建议,并就此进行展望。

ISSR标记分析油菜黑胫病原菌遗传多样性

利用ISSR分子标记技术分析了油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）的遗传多样性。分离获得国内菌株84株，并以15株国外（英国、加拿大、波兰）油菜黑胫病菌菌株作为参照，利用筛选出的24条引物对这99株病原菌进行ISSR—PCR扩增。共扩增出245条带，遗传相似性系数为0．65～1．00，国内和国外油菜黑胫病菌菌株很明显被分为两个菌群，中国84株菌基本按地理来源分为5个类群，只有江苏省菌株分布于各个类群。各省的Nei’s基因多样性指数范围是0．1081～0．2527，而香农（Shannon’S）信息指数的范围是0．1575～0．3726，顺序为江苏〉湖北〉安徽〉内蒙古〉上海〉四川。中国与英国和加拿大菌株的遗传一致度分别为0．8343和0．7839。

油菜黑胫病菌ISSR-PCR反应体系优化

通过正交试验设计,对油菜黑胫病菌ISSR-PCR反应体系的各影响因素进行研究,即从Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物以及模板浓度5因素4水平进行优化,筛选并建立了适合油菜黑胫病菌ISSR分子标记的最佳反应体系,即在25μL反应体系中包含Taq DNA酶1 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.6μmol/L,模板40 ng以及2.5μL 10×Buffer。并以扩增条带丰富、清晰、稳定性强为原则,从所查找的110条引物中筛选出24条适于油菜黑胫病菌ISSR-PCR扩增的引物,同时对各引物的最佳退火温度进行了筛选确定,经对20株病原菌的稳定性检测,证实该优化体系可用于研究该病原菌的遗传多样性。

油菜黑胫病病原菌致病力差异分析

通过人工接种的方法研究来自不同地区30份菌株的致病力(性)。结果表明,不同菌株间致病力存在差异,病情等级为1.92~8.84,以强致病力为主,占比73.3%。不同寄主对菌株的抗感反应也存在差异,可为病原菌菌群划分和育种提供理论依据。

油菜pgip基因去信号肽片段在毕赤酵母中的分泌表达

为探讨PGIP蛋白与PG的互作及pgip基因在油菜抗黑胫菌病中的作用,根据Gen Bank中油菜pgip9、pgip15CDS序列设计引物,并去掉信号肽序列,以接种黑胫病病原菌Leptosphaeria biglobosa（菌株NM-1）7 d后油菜叶片总RNA反转录的c DNA为模板,PCR扩增出pgip9、pgip15除信号肽以外的编码区片段,并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PICZαA中构建重组质粒p PICZαA-pgip9、p PICZαA-pgip15。重组质粒经单、双酶切、菌落PCR筛选鉴定后热激化法转化酵母细胞PMAD16,再经Zeocin^TM的YPD平板和菌落PCR筛选鉴定,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测,均在36-37 k Da处出现单一的蛋白条带,蛋白分泌表达成功。通过对pgip基因的体外表达,为探讨PGIP蛋白与PG的互作及pgip基因在抗油菜黑胫菌病中的作用奠定基础。

油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L.biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化(ATMT)油菜黑胫病菌L.biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素:潮霉素B浓度为50μg/mL,转化受体(分生孢子)培养时间为15 d(20℃),浓度为2×10^(7-8)孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L.biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。

油菜黑胫病菌T-DNA插入致病力减弱突变体的筛选及侧翼序列分析

为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体。并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,T1、T3、T4、T7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有明显差异,T9、T11与野生型nm-1相比,菌丝形态致密,没有产孢;T1、T3、T4、T7、T9突变体生长速率比野生型nm-1快,而T11显著低于野生型nm-1;6个突变体的产孢能力与野生型nm-1相比都显著下降;Southern Blot分析其T-DNA插入的拷贝数为单拷贝插入。并通过Hi TAIL-PCR技术扩增了6个突变体的右侧翼序列,经Blast比对分析,初步确定了T-DNA插入Leptosphaeria biglobosa基因组的位置,T-DNA插入的右侧翼序列可能为致病基因的部分序列,为进一步确定油菜黑胫病菌致病基因及其功能提供参考依据。

农杆菌介导油菜黑胫病菌遗传转化

为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系,以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP为载体,农杆菌LBA4404为介体,对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢子浓度10^(6)个/mL,农杆菌OD600值0.6,乙酰丁香酮浓度200μmol/mL,pH 5.8,25℃,共培养4 d,获得120~161个转化子。随机选取26个转化子连续培养5代能够稳定遗传,绿色荧光蛋白基因gfp表达的菌丝和孢子可见绿色荧光。PCR鉴定发现T-DNA已整合进油菜黑胫病菌基因组中,Southern blot鉴定发现T-DNA以单拷贝的形式插入黑胫病菌中,转化子均能够稳定遗传。建立油菜黑胫病菌遗传转化体系为该病菌的致病机制研究和功能基因分析奠定了基础。

油菜黑胫病及其防控措施综述

油菜黑胫病是世界范围内广泛流行的真菌病害,由病原菌强毒型Leptosphaeria maculans和弱毒型Leptosphaeria biglobosa单独侵染或复合侵染引起,威胁着油菜籽的产量、品质,同时影响着世界油菜籽贸易。L. maculans曾造成加拿大、澳大利亚油菜的严重减产,目前暂未在我国发现,属于检疫性病原菌。每年我国进口的油菜籽主要来自L. maculans流行的地区,如澳大利亚、加拿大和乌克兰。L. maculans随油菜籽贸易传入我国的风险极高,加之我国目前的栽培品种对其的抗性水平较低,因此有必要对黑胫病及其病原菌进行更深入的了解。文章综述了油菜黑胫病的病原菌、分布及入侵、造成的影响以及澳大利亚和加拿大采用的防治措施,旨在增加对L. maculans更多的知识储备和更全面的认识,为我国L. maculans的预警及今后的防控提供理论基础。

油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌的LAMP检测方法的建立

油菜黑胫病和油菜茎基溃疡病分别由子囊菌Leptosphaeria biglobosa和L.maculans引起。我国油菜产区仅发现L.biglobosa,未发现L.maculans。因而,L.maculans是我国的对外检疫性对象。这两种真菌形态相似,引起的病害症状相似,给田间快速准确鉴定带来难度。本研究基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),建立了快速检测L.biglobosa和L.maculans的方法。根据ITS-rDNA序列设计了5条检测L.biglobosa的LAMP引物和6条检测L.maculans的LAMP引物,检测L.biglobosa和L.maculans的最适温度为65℃,反应时间分别为40 min和50 min。两组引物检测特异性高,检测的模板DNA极限达到fg级,与常规PCR检测相比,LAMP检测L.biglobosa和L.maculans灵敏度分别提高了100倍和1000倍。在病害样品实际检测中,采用两种LAMP体系,分别检测了9株罹病油菜茎秆中的病原菌。结果表明:所有茎秆中的病原菌均为L.biglobosa,没有检测到L.maculans,与特异性PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP检测方法为快速高通量检测L.biglobosa和L.maculans奠定了基础。

进境油菜籽中黑胫病菌和茎基溃疡病菌的检测

为准确鉴定从进境澳大利亚油菜籽样品中分离的真菌分离物,利用形态学特征、PCR检测、序列分析以及致病性测试等方法对分离物6382-43和6382-51进行了鉴定试验。结果表明,分离物6382-43的形态特征和油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans相似,菌丝生长较慢,菌落边缘不规则,不产生色素。油菜茎基溃疡病菌特异性引物LmacF/LmacR检测为PCR阳性;ITS区序列和油菜茎基溃疡病菌的序列相似性为99.8%;接种幼嫩油菜子叶产生油菜茎基溃疡病的典型症状。分离物6382-51的形态特征和油菜黑胫病菌L.biglobosa相似,菌丝生长较快,菌落边缘规则,产生色素;油菜黑胫病菌特异性引物LbigF/LmacR检测为PCR阳性;ITS区序列和油菜黑胫病菌的序列相似性为100%;接种幼嫩油菜子叶产生油菜黑胫病的典型症状。根据分离物的形态特征、PCR检测结果、序列分析以及致病性测试结果,将进境澳大利亚油菜籽样品中的真菌分离物6382-43和6382-51分别鉴定为油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans和油菜黑胫病菌L.biglobosa。

油菜黑胫病对油菜产量及农艺性状的影响

通过人工接种和大田自然发病调查两种方法,探讨了油菜黑胫病不同病害级别对油菜单株产量及农艺性状株高、分枝数、角果数、角粒数和千粒重的影响。结果表明:(1)不同级别间病株产量差异显著,产量损失随病害侵染程度的增加而加重,当病害级别达5级时,3个试验品种单株平均产量损失率达50.5%;(2)产量性状与病害级别间呈显著或极显著负相关,影响顺序为角粒数>角果数>千粒重>分枝数>株高。为油菜黑胫病的预测预报和抗病品种选育提供帮助。