Let-7a-1前体和K-ras在食管癌中的表达及意义

目的探讨let-7a-1前体和K-ras在食管癌中的表达、临床意义及两者的内在联系。方法应用RT-PCR法检测20例食管癌和正常食管黏膜中let-7a-1前体mRNA和K-ras mRNA的表达情况。结果 let-7a-1前体mRNA在食管癌中低表达(<50%)的阳性率为40%(8/20),其表达量比正常食管黏膜低(P<0.05);K-ras mRNA在食管癌中高表达(>200%)的阳性率为35%(7/20),其表达量与正常食管黏膜无差异(P>0.05);let-7a-1与K-ras的表达量同其余生物病理学特征及两者在食管癌中无明显相关性(P>0.05)。结论 let-7a-1前体在食管癌中低表达,表明其可能作为抑癌基因参与食管癌的发生发展过程。

Let-7a-3p靶向IGF1R抑制人肺癌A549细胞中肿瘤干细胞的活性

目的:研究let-7a-3p对人肺癌细胞A549的肿瘤干细胞活性的影响及其相关机制。方法:RT-qPCR法比较肺癌细胞系A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B中let-7a-3p的水平。A549肺癌细胞株分别转染let-7a-3p模拟物(let-7a-3p mimics)和其阴性对照(negative control mimic),分别作为let-7a-3p组和negative control组,并设立未转染对照(non-transfected)组,采用RT-qPCR法检测各组细胞let-7a-3p的水平。瘤球形成实验检测3组肿瘤干细胞瘤球形成能力。流式细胞术检测肿瘤干细胞比例。Western blot法检测3组细胞NANOG、OCT4和胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的蛋白表达水平。运用生物信息学方法预测let-7a-3p的靶基因,双萤光素酶实验检测let-7a-3p与IGF1R的关系。Western blot法检测IGF1R过表达对let-7a-3p抑制肿瘤干细胞的拮抗作用。建立皮下移植瘤模型观察let-7a-3p的体内作用。结果:肺癌细胞系中let-7a-3p的表达水平均明显低于正常支气管上皮细胞系(P<0.01)。let-7a-3p组A549细胞中let-7a-3p的表达水平较non-transfected组明显上调(P<0.01)。瘤球形成实验发现,let-7a-3p组的瘤球数量明显低于non-transfected组。流式细胞术检测发现,let-7a-3p组的CD133^+细胞比例明显低于non-transfected组(P<0.01)。Western blot实验显示,let-7a-3p组的NANOG蛋白和OCT4蛋白表达量比non-transfected组明显降低(P<0.01)。生物信息学预测结果表明,let-7a-3p与IGF1R的3’-UTR区部分互补,IGF1R可能是let-7a-3p的靶基因。双萤光素酶实验证实,IGF1R为let-7a-3p的直接下游靶基因。Let-7a-3p组的IGF1R蛋白表达量明显降低(P<0.01)。Let-7a-3p组的皮下移植瘤明显小于non-transfected组。结论:let-7a-3p可能通过降低下游靶基因IGF1R的水平影响肺癌干细胞相关蛋白表达,抑制肺癌干细胞潜能。

let-7a靶向细胞因子信号传导抑制物1调控头颈部鳞状细胞癌免疫逃逸的作用机制研究

目的:研究微小RNA亚型let-7a靶向细胞因子信号传导抑制物1(SOCS1)调控头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)免疫逃逸的作用及机制。方法:常规培养人SCCHN细胞株舌鳞癌细胞(SCC25),采用双荧光素酶报告基因系统检测SOCS1是否为let-7a的作用靶点。将let-7a模拟物及阴性对照序列、抑制物及阴性对照分别转染人SCCHN细胞株SCC25,并将其分为空白对照组、let-7amimic组、mimic-NC组、let-7ainhibitor组和inhibitor-NC组。采用蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测各组SOCS1和细胞程序性死亡-1(PD-1)及程序性死亡配体1(PD-L1)的蛋白相对表达量,实时荧光定量聚合酶链反应(rt-qPCR)检测各组let-7a、SOCS1与PD-1、PD-L1的mRNA相对表达量;转染48 h后,采用流式细胞术检测细胞周期、凋亡。T细胞亚群CD4^(+)、CD8^(+)分别与SCCHN细胞进行共培养,采用流式细胞术检测共培养组T细胞亚群CD4^(+)、CD8^(+)数目。结果:双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,转染野生型载体的细胞荧光素酶活性均下调(F=26.566,P<0.05),提示let-7a可靶向结合SOCS13′UTR序列。Westernblot结果显示,空白对照组SOCS1蛋白相对表达量高于let-7amimic组;人SCCHN细胞转染48 h后,let-7amimic组SOCS1、PD-1及PD-L1蛋白相对表达量最低,与各干预组差异有统计学意义(t=6.427,t=7.102,t=5.287;P<0.05),let-7ainhibitor组SOCS1、PD-1及PD-L1蛋白相对表达量最高,与各干预组差异有统计学意义(t=6.357,t=9.647,t=7.256;P<0.05)。rt-qPCR结果显示,人SCCHN细胞转染48 h后,let-7amimic组let-7amRNA相对表达量最高,与各干预组差异具有统计学意义(t=10.254,t=7.452,t=6.328;P<0.05),let-7ainhibitor组let-7amRNA相对表达量最低,与各干预组差异有统计学意义(t=6.257;t=6.901,t=5.287;P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,与空白对照组比较,let-7amimic组SCCHN细胞处于G0/G_(1)期的比例明显降低(t=5.286,P<0.05),处于S期的细胞比例相对增高,而let-7ainhibitor组CCHN细胞处于G0/G_(1)期的比例明显升高,差异有统计学意义(t=9.614,P<0.05),处于S期的细胞比例相对降低;let-7amimic组SCCHN细胞凋亡率明显高于其他干预组(t=11.257,t=8.617,t=9.627;P<0.05);SCCHN细胞转染48 h后,let-7amimic组CD4^(+)、CD4^(+)与CD8^(+)比值(CD4^(+)/CD8^(+))水平最高,与其他4组比较差异有统计学意义(tCD4^(+)=9.257,t=8.654,t=6.647,t=7.152;tCD4^(+)/CD8^(+)=4.251,t=4.652,t=5.921,t=4.275;P<0.05);let-7ainhibitor组CD4^(+)和CD4^(+)/CD8^(+)水平最低,与其他4组比较差异有统计学意义(tCD4^(+)=4.357,t=5.267,t=5.267,t=5.415;t_(CD4^(+)/CD8^(+))=4.675,t=4.592,t=4.627,t=4.159;P<0.05)。结论:let-7a过表达可能通过抑制PD-1及PD-1L信号通路而参与SCCHN细胞免疫逃逸,其机制可能与靶向调控SOCS1有关。

lncRNA NEAT1通过抑制miR-let-7a激活BZW2促进喉乳头状瘤细胞的增殖和凋亡逃逸

目的探讨长链非编码RNA核富集转录本1(lncRNA NEAT1)对喉乳头状瘤(LP)细胞的增殖和凋亡逃逸的调控作用和机制。方法培养人喉乳头状瘤细胞Hs840.T,将正常人口腔上皮细胞(HOECs)作为对照。将Hs840.T分为lncRNA NEAT1过表达载体(pcDNA-NEAT1)组、pcDNA-NEAT1阴性对照(pcDNA-NC)组、沉默lncRNA NEAT1的小干扰RNA载体(siNEAT1)组、siNEAT1的阴性对照(siNC)组、miR-let-7a的模拟物(mimic)组、mimic阴性对照(mimic-NC)组、miR-let-7a抑制剂(inhibitor)组、inhibitor阴性对照(inhibitor-NC)组、沉默碱性亮氨酸拉链和W2结构域2(BZW2)的小干扰RNA载体(siBZW2)组、siBZW2的阴性对照(siBZW2-NC)组、pcDNA-NEAT1联合siBZW2给药(pcDNA-NEAT1+siBZW2)组、pcDNA-NEAT1联合siBZW2-NC给药(pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC)组。qRT-PCR检测各组中lncRNA NEAT1及其预测靶分子miR-let-7a的表达。Western blot和qRT-PCR检测BZW2的表达。双荧光素酶报告基因实验检测Hs840.T中lncRNA NEAT1和miR-let-7a以及miR-let-7a和BZW2的靶向关系。MTT实验测定Hs840.T的增殖能力。Annexin V-FITC/PI双染法检测Hs840.T的凋亡逃逸能力。结果Hs840.T中的lncRNA NEAT1和BZW2表达高于HOECs(P<0.05),而miR-let-7a表达低于HOECs(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明,Hs840.T中lncRNA NEAT1吸附抑制miR-let-7a并上调BZW2的表达(P<0.05),且BZW2是miR-let-7a的靶基因。与pcDNA-NC组相比,pcDNA-NEAT1组Hs840.T的增殖率增加(P<0.05),早期、晚期凋亡率均降低(P<0.05);与siNC组相比,siNEAT1组Hs840.T的增殖率降低(P<0.05),早期、晚期凋亡率均增加(P<0.05)。另外,与pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC组相比,pcDNA-NEAT1+siBZW2组Hs840.T的增殖率降低(P<0.05),早期、晚期凋亡率均增高(P<0.05)。结论lncRNA NEAT1通过抑制miR-let-7a激活BZW2促进LP细胞的增殖和凋亡逃逸。

Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立

目的:构建携带let-7a基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma,ES)细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。方法:通过Gateway克隆技术,扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段,与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与母载体——pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应,生成目的质粒——pLV.Des2d.P/neo-EF1A>eGFP/let-7a;通过PCR及测序验证目的质粒;将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株A673和SK-ES-1获得A673/let-7a、SKES-1/let-7a细胞株;通过real-time PCR检测稳定转染细胞株内let-7a的表达水平,Western blot检测其靶基因CDK6的表达。结果:PCR证实获得的目的条带与理论值相符,测序分析证实携带let-7a的真核表达载体插入序列及位点正确;real-time PCR及Western blot检测结果显示,与转染空载质粒及未处理组的A673、SK-ES-1细胞株相比,稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a,分别达到8.5倍(P=0.000)和6.5倍(P=0.001),差异具有统计学意义;且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少。结论:成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。

二甲双胍抑制鼻咽癌细胞CNE-1增殖并诱导其凋亡的作用机制

目的二甲双胍可抑制鼻咽癌细胞的增殖,但作用机制尚不清楚。文章研究二甲双胍对鼻咽癌细胞CNE-1增殖与凋亡的效应,并探讨miR-let-7a、IGF-1R在其中的作用。方法分别以不同浓度二甲双胍(0、5、10、20、40、80mmol/L)干预鼻咽癌细胞CNE-124h后,采用CCK8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪技术分析细胞凋亡率;实时荧光定量PCR(qPCR)检测bcl-2、bax、IGF-1RmRNA表达水平,miR-let-7a的表达水平;Westernblot方法检测IGF-1R蛋白的表达。结果CCK8结果显示,各浓度组二甲双胍处理细胞24h后,二甲双胍可抑制CNE-1细胞的增殖活性,随药物浓度增高抑制作用呈增强趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪凋亡分析结果显示,0、5、10、20、40mmol/L二甲双胍处理后总凋亡率分别为(6.17±0.74)%、(8.11±1.29)%、(11.97±3.82)%、(13.94±2.98)%、(24.2±2.79)%;与0mmol/L二甲双胍处理比较相比,10、20、40mmol/L二甲双胍处理后凋亡率随浓度升高而呈上升趋势(P<0.05)。qPCR结果显示,0、5、10、20mmol/L浓度二甲双胍作用后24h后,CNE-1细胞的bcl-2、bcl-2/bax、IGF-1R、miR-let-7amRNA表达水平随二甲双胍浓度增加而逐渐下调,而bax基因表达水平则上调,与0mmol/L二甲双胍作用后相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论二甲双胍有抑制鼻咽癌细胞CNE-1增殖并诱导其凋亡的作用,其机制可能与miR-let-7a表达上调、IGF-1R表达下调有关。

let-7a-5p在急性呼吸窘迫综合征中作用

目的探讨let-7a-5p靶向调节转化生长因子-β受体1(transforming growth factor-βreceptor 1,TGF-βR1)在急性呼吸窘迫综合征中作用及机制。方法 NIH3T3细胞经转染let-7a-5p mimics或let-7a-5p inhibitor等后,分为let-7a-5p增强组、let-7a-5p增强对照组、let-7a-5p抑制组、let-7a-5p抑制对照组和阴性对照组,检测各组细胞中let-7a-5p的相对表达量,转染成功后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢmRNA相对表达量,采用Western blot法检测各组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢ蛋白相对表达量。将HEK293细胞分为实验组和对照组,分别转染let-7a-5p mimic和阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定2组相对荧光素酶活性的荧光值。结果转染后let-7a-5p增强组let-7a-5p相对表达量(191 215.66±115 55.57)高于阴性对照组(251.85±85.12)和let-7a-5p抑制组let-7a-5p(1.14±0.22)(P<0.05),阴性对照组高于let-7a-5p抑制组(P<0.05);let-7a-5p增强组细胞中Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢmRNA相对表达量低于阴性对照组和let-7a-5p抑制组(P<0.05),阴性对照组低于let-7a-5p抑制组(P<0.05);let-7a-5p增强对照组和let-7a-5p抑制对照组Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢmRNA相对表达量与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),5组细胞中TGF-βR1mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);let-7a-5p增强组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢ蛋白表达灰度值低于阴性对照组和let-7a-5p抑制组(P<0.05),阴性对照组低于let-7a-5p抑制组(P<0.05),let-7a-5p增强对照组和let-7a-5p抑制对照组细胞中TGF-βR1、Smad2、Smad3、COLⅠ、COLⅢ蛋白表达灰度值与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);双荧光素酶报告基因检测结果显示,对照组细胞相对荧光素酶活性(1.00±0.00)高于实验组(0.34±0.13)(P<0.05)。结论 let-7a-5可通过抑制TGF-βR1蛋白翻译而减轻肺纤维化,进而延缓急性呼吸窘迫综合征进程。

Let-7a对尤文氏肉瘤细胞生物学行为的影响

目的:探讨微小RNA(microRNA,miRNA)let-7a对尤文氏肉瘤A673和SK-ES-1细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法:将成熟的let-7a片段(has-miR-let-7a mimic)转染至A673和SK-ES-1细胞中,实验分为转染组(转染has-miR-let-7a mimic)、对照组(转染has-miR-let-7a mimic-control)和未转染组(仅加入脂质体)。Has-miR-let-7a mimic转染后,应用实时荧光定量-PCR法检测细胞中let-7a的表达,CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,FCM法检测细胞的周期分布和凋亡变化,Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测细胞中细胞周期依赖性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)、Rb和磷酸化-Rb(phospho-Rb,p-Rb)蛋白的表达。结果:与未转染组和对照组比较,转染has-miR-let-7a mimic后的A673和SK-ES-1细胞中let-7a的表达水平明显上调(P<0.01),细胞增殖受到抑制(P<0.01),G0/G1期细胞所占比例上升(P<0.01),细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显下降(P<0.01),细胞中CDK6和p-Rb蛋白的表达水平明显下降(P<0.01),而Rb蛋白的表达水平无明显变化。结论:Let-7a可抑制尤文氏肉瘤A673和SK-ES-1细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡,这一作用可能部分依赖于let-7a靶向抑制CDK6的表达。

叶下珠复方Ⅱ号对肝癌HepG2细胞lncRNA CCAT1表达的调控作用

目的:探讨叶下珠复方Ⅱ号通过抑制长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)的表达,恢复小分子RNA let-7a(microRNA let-7a)的表达,从而发挥抗肝癌的作用机制。方法:应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测正常肝细胞LO2与肝癌HepG2细胞lncRNA CCAT1的表达,比较2种细胞的表达差异。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定肝癌HepG2在不同浓度的叶下珠复方Ⅱ号与5-氟尿嘧啶(5-FU)作用24,48,72 h后细胞增殖的情况。体外培养肝癌HepG2细胞,设空白组,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8 g·L^(-1)),应用Real-time PCR检测各组lncRNA CCAT1,microRNA let-7a和其靶基因高迁移率蛋白A2(HMGA2),N-RAS基因(N-RAS)mRNA表达改变;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组HMGA2和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的蛋白表达。结果:与LO2细胞比较,肝癌HepG2细胞lncRNA CCAT1的表达明显上调(P<0.05)。通过MTT比色实验测定出叶下珠复方Ⅱ号和5-FU作用于肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度(IC_(50))分别为1.649,0.044 648 g·L^(-1);与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8 g·L^(-1))均可抑制肝癌HepG2细胞增殖(P<0.05),叶下珠复方Ⅱ号高质量浓度组(1.6 g·L^(-1))最为显著。Real-time PCR结果显示,与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8 g·L^(-1))lncRNA CCAT1的表达明显抑制(P<0.05),高质量浓度组microRNA let-7a表达明显上调(P<0.05),叶下珠复方Ⅱ高、低质量浓度组HMGA2 mRNA表达均明显下调,高质量浓度组N-RAS mRNA表达明显下调(P<0.05)。Western blot结果表明,与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8 g·L^(-1))的HMGA2,Cyclin D1蛋白表达均明显下调(P<0.05)。结论:叶下珠复方Ⅱ号可以通过抑制HepG2细胞lncRNA CCAT1表达,恢复microRNA let-7a表达,并抑制其下游相关靶基因的mRNA和蛋白表达,进而抑制肝癌细胞增殖,发挥抗肝癌作用。