5-杂氮-2'-脱氧胞苷对肺癌细胞小分子RNA let-7a-2表达的影响

目的:观察去甲基化药物对人肺癌A549和H1299细胞增殖、凋亡以及小分子RNA let-7a-2表达的影响。方法:以不同浓度的5-杂氮-2'-脱氧胞苷(DAC)对肺癌细胞进行处理后,CCK-8检测对细胞增殖的影响,AnnexinV-PI双染法检测对细胞凋亡的影响,qRT-PCR对let-7a-2的表达进行检测。结果:A549和H1299细胞经不同浓度DAC处理后细胞增殖受到明显抑制,以60μM浓度DAC处理后d5抑制率分别为(40.80±6.50)%和(47.24±4.95)%(均P<0.05),同时细胞呈现显著性早期凋亡,凋亡百分比分别达(64.58±4.21)和(59.61±5.69)(均P<0.05)。20μM、40μM、60μM DAC处理后let-7a-2的表达量在A549中分别为(10.86±0.30)、(5.02±2.83)、(17.79±1.95),比对照组(1.12±0.24)显著上调;在H1299中分别为(55.13±5.69)、(35.67±4.13)、(14.94±2.46),比对照组(1.31±0.56)显著上调。结论:DAC处理可抑制肺癌A549和H1299细胞增殖、促进细胞凋亡,上调let-7a-2的表达,let-7a-2基因调控区域超甲基化可能是其在肺癌细胞中表达异常的机制之一。

Let-7a-2 rs629367和pri-miR-218 rs11134527与肺癌铂类联合化疗毒副反应的相关性研究

目的:探讨Let-7a-2 rs629367及pri-miR-218 rs11134527与肺癌铂类联合化疗毒副反应的相关性,探索其作为毒副反应预测生物标志物的可能。方法:纳入467例2011年11月至2013年5月期间在中南大学湘雅医院和附属肿瘤医院住院,并接受至少2个周期铂类联合化疗的肺癌患者,使用飞行时间质谱对rs629367和rs11134527进行基因分型,采用卡方检验分析毒副反应与临床特征的相关性,并采用非条件逻辑回归分析评估基因型与化疗后毒副反应的相关性。结果:rs629367及rs11134527位点的等位基因与肺癌铂类联合化疗的总毒副反应、胃肠道毒副反应及血液毒副反应均无显著相关性。通过分层分析发现,rs11134527在女性人群与总毒副反应(加性模型:校正OR=0.442,95%CI=0.214~0.914,P=0.028;显性模型:校正OR=0.283,95%CI=0.109~0.732,P=0.009)和胃肠道毒副反应(加性模型:校正OR=0.388,95%CI=0.182~0.826,P=0.014;显性模型:校正OR=0.231,95%CI=0.089~0.598,P=0.003)显著相关;rs11134527在非小细胞肺癌(加性模型:校正OR=0.655,95%CI=0.452~0.950,P=0.026;显性模型:校正OR=0.497,95%CI=0.300~0.826,P=0.007)和肺腺癌(加性模型:校正OR=2.063,95%CI=1.187~3.585,P=0.010)与血液毒副反应显著相关。结论:Let-7a-2 rs629367与肺癌铂类联合化疗毒副反应无相关性;pri-miR-218 rs11134527与女性肺癌患者铂类药物化疗总毒副反应和胃肠道毒副反应,及非小细胞肺癌、特别是肺腺癌患者血液毒副反应显著相关,有可能作为预测该类人群铂类药物化疗相关不良反应的候选生物标志物。

食管鳞癌中microRNA let-7a-3甲基化与IGF-Ⅱ的相关性

目的探讨食管鳞癌组织中microRNA let-7a-3甲基化状态与血浆中类胰岛素样生长因子2(Insulin like growth factor 2,IGF-Ⅱ)表达的相关性。方法采用甲基化特异性PCR法(Methylation specific PCR,qMSP)检测83例食管癌及相对应的癌旁正常组织中let-7a-3甲基化状态,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆中IGF-Ⅱ的表达水平。结果83例食管鳞癌患者癌组织中的microRNA let-7a-3甲基化程度显著高于癌旁正常组织(P<0.001)。83例食管鳞癌患者血浆中IGF-Ⅱ的表达水平与let-7a-3基因的甲基化程度总体上呈正相关,具有统计学意义(r=0.600,P<0.001)。结论microRNA let-7a-3可能通过对下游分子的甲基化调控参与食管鳞癌的发生发展,这对了解食管鳞癌形成的机制具有重要意义,可为食管鳞癌的诊断和预后提供依据。

lncRNA NEAT1通过抑制miR-let-7a激活BZW2促进喉乳头状瘤细胞的增殖和凋亡逃逸

目的探讨长链非编码RNA核富集转录本1(lncRNA NEAT1)对喉乳头状瘤(LP)细胞的增殖和凋亡逃逸的调控作用和机制。方法培养人喉乳头状瘤细胞Hs840.T,将正常人口腔上皮细胞(HOECs)作为对照。将Hs840.T分为lncRNA NEAT1过表达载体(pcDNA-NEAT1)组、pcDNA-NEAT1阴性对照(pcDNA-NC)组、沉默lncRNA NEAT1的小干扰RNA载体(siNEAT1)组、siNEAT1的阴性对照(siNC)组、miR-let-7a的模拟物(mimic)组、mimic阴性对照(mimic-NC)组、miR-let-7a抑制剂(inhibitor)组、inhibitor阴性对照(inhibitor-NC)组、沉默碱性亮氨酸拉链和W2结构域2(BZW2)的小干扰RNA载体(siBZW2)组、siBZW2的阴性对照(siBZW2-NC)组、pcDNA-NEAT1联合siBZW2给药(pcDNA-NEAT1+siBZW2)组、pcDNA-NEAT1联合siBZW2-NC给药(pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC)组。qRT-PCR检测各组中lncRNA NEAT1及其预测靶分子miR-let-7a的表达。Western blot和qRT-PCR检测BZW2的表达。双荧光素酶报告基因实验检测Hs840.T中lncRNA NEAT1和miR-let-7a以及miR-let-7a和BZW2的靶向关系。MTT实验测定Hs840.T的增殖能力。Annexin V-FITC/PI双染法检测Hs840.T的凋亡逃逸能力。结果Hs840.T中的lncRNA NEAT1和BZW2表达高于HOECs(P<0.05),而miR-let-7a表达低于HOECs(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明,Hs840.T中lncRNA NEAT1吸附抑制miR-let-7a并上调BZW2的表达(P<0.05),且BZW2是miR-let-7a的靶基因。与pcDNA-NC组相比,pcDNA-NEAT1组Hs840.T的增殖率增加(P<0.05),早期、晚期凋亡率均降低(P<0.05);与siNC组相比,siNEAT1组Hs840.T的增殖率降低(P<0.05),早期、晚期凋亡率均增加(P<0.05)。另外,与pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC组相比,pcDNA-NEAT1+siBZW2组Hs840.T的增殖率降低(P<0.05),早期、晚期凋亡率均增高(P<0.05)。结论lncRNA NEAT1通过抑制miR-let-7a激活BZW2促进LP细胞的增殖和凋亡逃逸。

miRNA let-7a调控HMGA2表达抑制喉癌细胞增殖并促进其凋亡的作用机制

目的:探讨在喉癌细胞株Hep-2中上调miRNA let-7a的表达对高迁移率族蛋白(high mobility group A,HMGA2)的作用机制以及对喉癌细胞增殖的影响。方法:合成miRNA let-7a模拟体(let-7a mimics)并采用阳离子脂质体法转染入Hep-2内;分别用流式细胞术和MTT法检测let-7a高表达对细胞凋亡和增殖的影响;实时荧光PCR(Real-time q PCR)和Western blot检测上调let-7a后对HMGA2表达的影响。结果:本实验将let-7a mimics成功转染入Hep-2内,流式细胞术及MTT法检测显示Hep-2内let-7a的表达上调会抑制喉癌细胞的增殖,促进喉癌细胞的凋亡。RT-q PCR检测显示:let-7a mRNA在空白组和阴性对照组(NC组)的表达水平明显低于实验组(P<0.05);HMGA2 mRNA在空白组、NC组的表达水平明显高于实验组(P<0.01)。Western blot检测细胞中HMGA2蛋白的表达显示:实验组HMGA2蛋白的表达量明显低于空白组和NC组(P<0.01)。上述实验中空白组与NC组之间比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:let-7a能够显著下调HMGA2基因和蛋白的表达,抑制喉癌细胞的增殖,促进其凋亡,为喉癌基因靶向治疗提供坚实的理论基础。

108例汉族人群let-7a基因调控区多态性与糖尿病肾病的相关性分析

目的探寻循环miRNA let-7a与糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的关系,分析并评估let-7a调控区域单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)对DN疾病的易感性。方法 Real-time PCR检测病例组及对照组中let-7a的表达水平。生物信息学方法预测并筛选3个位于let-7a前体(let-7a-2)启动子调控区域标签SNP(Tag SNP),采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(RFLP-PCR)法对108例糖尿病肾病(DN)、104例糖尿病(DM)患者及62例健康人对照(CON)3个SNP进行基因分型。结果 Real-time PCR结果显示let-7a在DN、DM、CON三组中表达水平有显著差异(P<0.05)。let-7a-2基因调控区域rs1143770多态位点的CT杂合子基因型在DN、DM、CON三组间有显著差异(P<0.05),且在DM组和DN组CT+TT两基因型均依次较CON组显著升高(P=0.049;P=0.001)。结论 miRNA let-7a可能参与调控DN疾病,其启动子调控区rs1143770多态与中国汉族人群糖尿病肾病相关,可能是个潜在的功能位点。

CXCR4介导的鼻咽癌细胞系CNE2对顺铂耐药性的研究

目的:通过建立鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/DDP,研究CXCR4在耐药机制中的作用。方法:采用药物浓度逐步递增的方法建立顺铂耐药细胞系CNE2/DDP,利用MTT实验、RNA干扰技术、microRNA过表达技术、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等分析CXCR4在CNE2/DDP顺铂耐药机制中的作用,并同时对其下游的目的基因进行研究。结果:1鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/DDP中CXCR4基因的表达水平升高,当降低了CXCR4siRNA表达水平后,CNE2/DDP的顺铂耐药能力减弱;2CNE2/DDP中的let-7a表达水平降低,而bcl-2的表达水平升高。当利用let-7amimics过表达let-7a后,bcl-2的表达水平下降,CNE2/DDP耐药能力减弱;3CXCR4siRNA降低CXCR4的表达水平后,let-7a的表达水平上升。结论:首次发现CNE2/DDP的耐药能力较CNE2明显增强,IC50值增加了至少5倍,并且通过调控let-7a的表达,进而影响凋亡抑制基因bcl-2的表达来实现其对CNE2顺铂耐药能力的调节。