Hsa-let-7b-5p抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭

目的探讨hsa-let-7b-5p在非小细胞肺癌临床诊断和靶向治疗中的价值。方法收集2020年9月-10月的13对哈尔滨医科大学附属肿瘤医院病理类型相同的非小细胞肺癌癌组织及其癌旁组织,通过RNA-Seq获得差异表达的miRNA,并通过qRT-PCR验证候选miRNA在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达水平。通过CCK-8法、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验验证miRNA对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响。利用MiRDB、TarBase和ENCORI数据库预测靶基因,并利用FunRich工具进行基因富集分析。结果与癌旁组织及正常支气管上皮细胞系(Human bronchial epithelial cell,HBE)相比,hsa-let-7b-5p在非小细胞肺癌组织及非小细胞肺癌细胞系(A549、H1299、H358和H460)中低表达(P<0.05)。hsa-let-7b-5p的高表达可以抑制非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01)。靶基因预测及富集分析结果显示hsa-let-7b-5p的378个靶基因及其相关基因中,147个基因与hsa-let-7b-5p的表达呈负相关(P<0.05)。结论Hsa-let-7b-5p对非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭有抑制作用。

LncRNA MVIH通过调节let-7b-5p促进胃癌细胞顺铂耐药

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)MVIH与胃癌细胞顺铂耐药的关系及其调控机制。方法:构建胃癌顺铂耐药细胞,CCK8法检测细胞增殖能力和顺铂半数抑制浓度(IC50),并计算耐药系数;实时定量PCR(qRT-PCR)分析耐药细胞中lncRNA MVIH和let-7b-5p的表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bax和Caspase3的表达;通过lncLocator数据库和lncRNASNP2数据库分析lncRNA MVIH在细胞中的分布情况和可能调控的miRNA,双萤光素酶报告基因实验进行验证;生物信息学分析let-7b-5p在胃癌和癌旁组织的表达情况以及对胃癌预后的影响。结果:胃癌顺铂耐药细胞MGC803R中lncRNA MVIH的表达高于其亲本细胞MGC803(P<0.05);在MGC803R中转染siMVIH显著增加了顺铂诱导的细胞凋亡,凋亡相关蛋白Bax和Caspase3显著上调,同时抑制了其增殖(P<0.05);lncRNA MVIH富集在细胞质中,可以靶向调控let-7b-5p,且let-7b-5p在胃癌中低表达,并与胃癌预后呈正相关(P<0.05);在MGC803中同时转染siMVIH和let-7b-5p抑制剂,逆转了lncRNA MVIH对细胞顺铂敏感性的调控。结论:LncRNA MVIH通过调节let-7b-5p促进胃癌细胞顺铂耐药。

hsa-let-7b-5p靶向ΔNp63抑制HaCaT细胞的增殖、迁移和侵袭

目的研究在人表皮细胞中hsa-let-7b-5p的作用和其对ΔNp63表达变化的影响,探讨hsa-let-7b-5p如何影响人表皮细胞的生物功能。方法人角质形成细胞株(HaCaT)分别转染hsa-let-7b-5p mimic NC、hsa-let-7b-5p mimic、hsa-let-7b-5p inhibitor和hsa-let-7b-5p inhibitor NC,通过CCK8检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移和细胞侵袭,利用miRcode网站和RNAhybrid网站预测p63和hsa-let-7b-5p结合,利用实时荧光定量PCR检测hsa-let-7b-5p及p63表达情况。结果hsa-let-7b-5p的高表达对HaCaT细胞的增殖、迁移和侵袭均有抑制作用,hsa-let-7b-5p表达的抑制则促进了HaCaT细胞的增殖、迁移和侵袭。通过网站预测发现hsa-let-7b-5p可与对皮肤表皮细胞有重要作用的p63结合;实时定量PCR分析发现hsa-let-7b-5p影响p63的表达。结论hsa-let-7b-5p可能通过靶向p63 mRNA水平而在人表皮细胞中发挥作用。

miR-let-7b-5p对急性胰腺炎AR42J细胞凋亡及自噬的作用研究

目的探讨miR-let-7b-5p对急性胰腺炎AR42J细胞凋亡和自噬的影响。方法以未处理的AR42J细胞作为正常对照组,1×10^(-8) mol/L浓度的雨蛙素诱导大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J)24h建立体外急性胰腺炎模型,慢病毒携带miR-let-7b-5p的模拟物(miRNA mimic)、抑制物(miRNA inhibitio)和空病毒转染急性胰腺炎模型细胞作为miR-let-7b-5p过表达组、低表达组和阴性对照组,RT-qPCR验证转染效果,检测凋亡基因Caspase-3 mRNA和自噬基因LC3ⅡmRNA的表达量;Western Blot检测Caspase-3及LC3Ⅱ的蛋白表达。结果与正常对照组相比,阴性对照组的miRlet-7b-5p表达量显著降低(P<0.01),凋亡基因Caspase-3mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01),自噬基因LC3ⅡmRNA及蛋白表达增加(P<0.05)。与阴性对照组相比,过表达组miR-let-7b-5p表达量显著增加(P<0.01),凋亡基因Caspase-3mRNA及蛋白表达均减少(P<0.05),LC3ⅡmRNA及蛋白表达均增加(P<0.05);低表达组miR-let-7b-5p表达量显著降低(P<0.01),凋亡基因Caspase-3mRNA及蛋白表达均增加(P<0.05)、自噬基因LC3ⅡmRNA及蛋白表达均增加(P<0.05)。结论miR-let-7b-5p可调控急性胰腺炎AR42J细胞的凋亡基因Caspase-3和自噬基因LC3Ⅱ的表达,从而影响胰腺细胞的凋亡和自噬。

血液中低表达的微小RNA let-7b-5p对非小细胞肺癌的诊断价值

目的探索微小RNA let-7b-5p用于早期诊断非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者的可行性。方法从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库获取GSE152702、GSE171517、GSE27486以及GSE40738原始数据集,共包含145例NSCLC患者(NSCLC组)和83位健康人(对照组)的血液样本数据。NSCLC组数据涵盖肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)。采用Wilcoxon秩和检验和标准化均数差(standardized mean difference,SMD)比较NSCLC组和对照组的let-7b-5p表达水平。通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线的曲线下面积(area under the curve,AUC)以及诊断性meta分析的敏感度和特异度评估let-7b-5p诊断NSCLC(LUAD和LUSC)的效能。结果GSE152702、GSE27486以及GSE40738数据集显示,let-7b-5p在LUAD患者的血液中低表达(均P<0.05),GSE152702数据集还显示LUSC患者的血液中let-7b-5p表达低于对照组(P<0.05)。综合LUAD和LUSC组的SMD结果进一步明确NSCLC组血液中let-7b-5p表达较对照组下调(SMD=-0.50,95%CI:-0.75~-0.26)。ROC曲线和诊断性meta分析显示,血液中let-7b-5p的表达水平可区分NSCLC样本和正常样本(AUC=0.79,敏感度=0.71,特异度=0.76)。ROC曲线分析显示,let-7b-5p在NSCLC中的10个潜在靶基因[碱性亮氨酸拉链和W2结构域2(basic leucine zipper and W2 domains2,BZW2)、细胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A,CDC25A)、细胞分裂周期相关基因8(cell division cycle associated8,CDCA8)、Ⅲ型胶原α-1链(collagen typeⅢalpha 1 chain,COL3A1)、外纺锤体极样蛋白1(extra spindle pole bodies like 1,ESPL1)、高迁移率族AT-hook蛋白1(high mobility group AT-hook 1,HMGA1)、胰岛素样生长因子2结合蛋白3(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3,IGF2BP3)、NME/NM23核苷二磷酸激酶4(NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 4,NME4)、葡萄糖磷酸变位酶2样蛋白1(phosphoglucomutase 2 like 1,PGM2L1)以及核糖核苷酸还原酶调节亚基M2(ribonucleotide reductase regulatory subunit M2,RRM2)]可区分LUAD与正常肺样本(AUC=0.765~0.980)以及区分LUSC与正常肺样本(AUC=0.749~0.997)。结论检测血液中的let-7b-5p表达水平可能可作为诊断NSCLC(包括LUAD和LUSC)患者的有效手段。

Let-7b-5p靶向ETFA减轻高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的:探讨Let-7b-5p调控电子转移黄素蛋白A(ETFA)表达对高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法:体外培养VSMCs,分为正常对照组和钙化组。钙化组用含β-甘油磷酸钠(β-GP)的培养基培养14 d诱导VSMCs钙化,通过茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)染色观察VSMCs钙化情况。分别将Let-7b-5p mimic、Let-7b-5p inhibitor、ETFA siRNA及相应对照转染VSMCs,并诱导细胞钙化。用RT-qPCR法检测细胞Let-7b-5p、ETFA及Runx2表达,Western blotting法检测ETFA和Runx2蛋白表达。双荧光素酶实验验证Let-7b-5p与ETFA的靶向关系。结果:与正常对照组比较,钙化组出现明显的紫红色钙盐结节,Let-7b-5p表达显著下调,ETFA和成骨细胞因子Runx2表达明显上调(均P<0.05)。Pearson相关分析显示,Let-7b-5p与ETFA表达呈负相关关系(r=-0.785,P<0.001),ETFA与Runx2表达呈正相关关系(r=0.962,P<0.001)。Let-7b-5p mimic能显著降低钙化细胞Runx2和ETFA的表达及ALP活性,而Let-7b-5p inhibitor则相反。Let-7b-5p可靶向调控ETFA表达。沉默ETFA后,钙化VSMCs中ETFA和Runx2表达显著下降,钙盐结节明显减少。结论:Let-7b-5p可通过靶向抑制ETFA的表达抑制高磷诱导的VSMCs钙化。

IPI-504通过LINC00312/let-7b-5p/EBF1轴抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移

目的探讨IPI-504诱导的LINC00312对胰腺癌细胞增殖、迁移和上皮-间质转化的抑制作用,并阐明其作用机制。方法通过生物信息学分析预测let-7b-5p与LINC00312、EBF1 mRNA的潜在结合位点,应用双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。将PANC-1细胞分为对照组、IPI-504组、IPI-504+敲减对照组、IPI-504+敲减LINC00312组、IPI-504+NC mimics组、IPI-504+let-7b-5p mimics组和IPI-504+敲减EBF1组,实时荧光定量PCR检测细胞LINC00312和let-7b-5p的表达,CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell检测细胞迁移能力,Western blotting检测细胞EBF1蛋白表达。结果let-7b-5p与LINC00312、EBF1 mRNA结合,敲减LINC00312、转染let-7b-5p模拟物和敲减EBF1均降低经IPI-504处理的PANC-1细胞中EBF1蛋白表达,促进细胞增殖和迁移。结论IPI-504上调胰腺癌细胞LINC00312表达,LINC00312通过海绵化let-7b-5p上调EBF1表达,从而抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移。

miR-let-7b-5p靶向调控LIMD2对胃癌细胞间质-上皮转化的影响

目的:探究微小RNA(miR)-let-7b-5p靶向调控含LIM域2蛋白(LIMD2)对胃癌(GC)细胞间质-上皮转化(MET)的影响。方法:采用qRT-PCR检测GES-1、SCG-7901、MGC-803、BGC-823细胞中miR-let-7b-5p相对表达水平;构建绿色荧光蛋白(GFP)和miR-let-7b-5p稳定过表达细胞株,qRT-PCR法检测miR-let-7b-5p过表达效率;生物信息学和双荧光素酶实验预测并验证miR-let-7b-5p与LIMD2靶向关系;构建pcDNA5-LIMD2过表达载体,将细胞分为NC组、miR-let-7b-5p组、miR-let-7b-5p-pcDNA5组和miR-let-7b-5p-LIMD2组,Western Blot检测各组细胞中LIMD2、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达;Transwell法检测miR-let-7b-5p对MGC-803细胞侵袭能力的影响。结果:与GES-1相比,SCG-7901、MGC-803、BGC-823细胞中miR-let-7b-5p相对表达水平明显下降(P<0.05)。与NC组相比,miR-let-7b-5p组miR-let-7b-5p相对表达量升高(P<0.05),转染LIMD2-WT的细胞相对荧光素酶活性明显降低(P<0.05),LIMD2、Vimentin、N-cadherin蛋白表达下调(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05),细胞侵袭个数减少(P<0.05)。与miR-let-7b-5p组相比,miR-let-7b-5p-LIMD2组LIMD2、Vimentin、N-cadherin蛋白表达上调(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05),细胞侵袭个数增多(P<0.05)。结论:过表达miR-let-7b-5p可靶向下调LIMD2促进胃癌细胞的MET,从而有效改善肿瘤细胞的侵袭。

The Influence of Let-7b-5p Target Gene in Cholangiocarcinoma and its Bioinformatic Analysis

Objective:To analyze the biological functions and its clinical significance of let-7b-5p target gene in cholangiocarcinoma utilizing bioinformatics.Methods:The paper focuses on the let-7b-5p target gene,and predicts its biological functions as well as related signal pathways through GO biological function and KEGG signal pathway enrichment analysis.The STRING database and Cytoscape are used to construct a protein-protein interaction network to screen core genes.Results:The results of GO analysis showed that let-7b-5p target gene was mainly enriched in biological processes such as Small GTPase binding,Rho GTPase binding,and Rac GTPase binding.The results of KEGG analysis showed that let-7b-5p target gene was significantly enriched in key signaling pathways including Focal adhesion and ECM-receptor interaction.Through protein-protein interaction network and module analysis,CXCL8 and SDC2 were screened as the core site.Conclusion:let-7b-5p can participate in the regulation of biological functions of tumor cells in cholangiocarcinoma,suggesting that it may play an important role as a tumor suppressor gene and biomarker in the occurrence and development of cholangiocarcinoma,which provides new ideas for its diagnosis and treatment.

成纤维生长因子受体1通过控制微小RNA let-7b表达调节内皮细胞线粒体生源的作用研究

目的探索成纤维生长因子受体l（fihrohlast growth factor receptor1，FGFRl）在调控内皮稳态时对上游分子N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline、AcSDKP）的影响和下游微小RNAlet-7（microRNA let-7、miR let-7）的诱导作用及与内皮细胞线粒体生源的关系，以期最终研究FGFR1在内皮稳态中的调控作用。方法下调FGF／FGFRl信号通路，蛋白质印迹（Western印迹．WB）法和细胞免疫荧光（Immunofluorescence staining）技术检测线粒体融合蛋白MFN2（mitofusin-2）、OPA1（optic atrophy protein1）和分裂蛋白DRP1（dynamin-related protein-1）的表达；应用线粒体染色（MitoTraker Green）检测线粒体的生成；运用实时荧光定量核酸扩增（Real-time Quantitative PCR、qPCR）检测技术检测microRNA let-7的表达。结果FGFRl通过诱导microRNA let-7b一5p的生成促进AcSDKP维持线粒体的生源；AcSDKP修复细胞因子复合物Triple（TGF-β2、IL-1β和TNF-α）所引起microRNA let-7b-5p表达抑制与线粒体的生成密切相关；抑制microRNA let-7b-5p的表达后，AcSDKP失去促进线粒体生成的作用：上调microRNA let-7b-5p的表达后，可修复内皮细胞中因FGF／FGFRl底物FRS2（fibroblast growth factor receptor substrate）沉默所致通路缺失所致的线粒体生成障碍。结论FGFRl通过上调microRNA let-7b-5p的表达，促进线粒体的生成，从而在内皮细胞的稳态中起着十分重要的作用。

特发性癫痫患者外周血差异表达miRNA分析

目的分析特发性癫痫患者外周血差异表达miRNA。方法选取2019年1月至2020年1月在新疆维吾尔自治区人民医院神经内科治疗的特发性癫痫患者12例为病例组,选取同期于新疆维吾尔自治区人民医院门诊进行体检的健康者12例为对照组。采集受试者外周血,采用Illumina HiSeq 2000测序仪进行高通量测序,采用edgeR软件筛选差异表达miRNA,采用qPCR检测差异表达miRNA表达水平。结果共完成24个样本测序。各样本原始序列数据统计分析结果显示,原始序列中碱基的测序质量值>20的碱基占总碱基的百分比为92.56%~97.32%,原始序列中碱基的测序质量值>30的碱基占总碱基的百分比为88.01%~93.50%,碱基G和C的数量总和占总碱基数量的百分比为45.29%~52.09%;各样本样品待分析数据统计分析结果显示,原始序列中碱基的测序质量值>20的碱基占总碱基的百分比为95.87%~98.85%,原始序列中碱基的测序质量值>30的碱基占总碱基的百分比为95.30%~96.85%,碱基G和C的数量总和占总碱基数量的百分比为40.38%~47.58%。共检测出146个差异表达miRNA,与对照组相比,研究组共有98个miRNA表达上调,48个miRNA表达下调;其中差异倍数最大的5个差异表达miRNA分别为hsa-let-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p。扩增曲线分析结果显示,样本均经历了良好的扩增过程。熔解曲线分析结果显示,大多数曲线为单峰。病例组hsa-let-7b-3p、hsa-miR-92a-1-5p表达水平低于对照组,hsa-miR-6810-3p表达水平高于对照组(P<0.05)。结论与健康人相比,特发性癫痫患者外周血共有98个miRNA表达上调,48个miRNA表达下调;其中差异倍数最大的5个差异表达miRNA分别为hsa-let-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p,且可能只有hsa-let-7b-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-6810-3p参与了特发性癫痫的发生发展。