甘肃红豆草无色花青素还原酶LAR基因的克隆和表达分析

以甘肃红豆草为材料,采用RT-PCR法克隆无色花青素还原酶LAR基因,分析该功能基因在甘肃红豆草不同器官表达的差异性。结果表明,克隆的甘肃红豆草LAR基因,与Gen Bank已报道LAR基因(登录号:HM152981)序列相似性达到98.34%,其ORF长为1089 bp,编码362个氨基酸残基;其编码的氨基酸序列与不同属豆科物种的相似性存在较大的差异。基因序列已注册到Gen Bank,序列登录号为KP013623。LAR基因在甘肃红豆草不同器官表达差异较大;其中叶中表达量最高,其次是花和果,茎中表达量最低,这与器官间缩合单宁含量的变化规律一致。推测其表达与甘肃红豆草缩合单宁器官间的积累差异有关。这些研究结果也为探索缩合单宁积累和表达调控的机制提供基础。

CPB-LAR-GFP表达载体的构建及其在紫花苜蓿愈伤组织中的表达

以无色花青素还原酶编码基因LAR为靶序列,构建携带绿色荧光蛋白GFP和抗除草剂bar基因的双标记选择植物表达载体,通过农杆菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化,经PCR检测和PPT筛选出抗性愈伤组织,转基因紫花苜蓿愈伤组织的缩合单宁含量比对照高30.8%。试验证明重组基因已转化至紫花苜蓿愈伤组织中并发挥生理功能,为研究缩合单宁合成与代谢的分子调控机制和培育具有抗除草剂和抗臌胀病的牧草新品种奠定基础。

杨树LAR基因的克隆及表达对儿茶素合成的影响

无色花色素还原酶基因(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)是类黄酮生物合成途径中的一个重要基因,为了验证杨树中LAR的功能,明确LAR基因对抗病物质儿茶素合成的影响,本实验以接种后第6 d的一年生‘中林46’杨树树干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆了LAR基因的OFR序列,并构建LAR的过表达载体p CAMBIA1301-LAR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得了转LAR基因的烟草6株。用q RT-PCR检测转基因烟草的表达量,结果显示,在转基因植株中,LAR基因的表达量均显著上调。用高效液相色谱法检测转基因植株中的儿茶素含量,结果显示,6株转LAR的烟草植株中,有4株内源儿茶素含量显著升高。以上结果表明,中林46杨LAR是杨树类黄酮生物合成途径中的一个基因,该基因与儿茶素的合成有关。

桑树花青素合成相关基因MaLAR和MaUGAT的克隆与表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)是催化无色花青素转化为儿茶素的一个关键酶,是植物类黄酮生物合成路径中的一个下游酶,可抑制无色花青素在花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下转化为花青素;花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷⁃2⁃O⁃葡萄糖醛酸转移酶(cyanidin⁃3⁃O⁃glucoside 2⁃O⁃glucuronosyltransferase,UGAT)是植物花青素生物合成路径中一个关键酶,其催化花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷转化为花青素3⁃O⁃(2⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸基)⁃β⁃D⁃葡萄糖苷,使得无色花青素最终转化为稳定的花色苷物质而累积在果实中。通过与川桑(Morus notabilis)基因组数据库进行比对鉴定到了MaLAR和MaUGAT基因,并以粤椹大10与和田白桑的桑椹cDNA为模板克隆了MaLAR和MaUGAT基因。聚类分析结果表明粤椹大10 MaLAR与甜樱桃(Prunus avium)亲缘关系较近,和田白桑MaLAR与川桑亲缘关系较近;粤椹大10 MaUGAT与和田白桑MaUGAT均与川桑亲缘关系较近,均属于蔷薇目。实时荧光定量PCR检测表明MaLAR在和田白桑桑椹S1—S3阶段的表达水平均高于粤椹大10;而MaUGAT则在粤椹大10桑椹S2—S3阶段中表达水平显著高于和田白桑。研究表明MaLAR在桑树花青素合成途径中可能起负调控作用,而MaUGAT在桑树花青素合成途径中可能起正调控作用。

砧木对‘赤霞珠9’葡萄果实发育及隐色花色素还原酶基因表达的影响

以‘赤霞珠’嫁接苗和自根苗果实为试材,用Trizol法,对果皮和果肉RNA进行提取和纯化,利用RT-PCR技术对果实隐色花色素还原酶(LAR)转录水平进行研究。结果表明:‘5BB’‘SO4’和‘101-14MG’均增加了‘赤霞珠’葡萄枝条N素质量分数,‘SO4’增加了P素质量分数,‘101-14MG’增加了K素质量分数;‘5BB’和‘SO4’增大了‘赤霞珠’葡萄果粒,‘5BB’使‘赤霞珠’葡萄提前8d转色,‘SO4’拉长了果蒂长度,增加了果穗松散度;在整个‘赤霞珠’果实发育期,各处理果实隐色花色素还原酶活性呈现逐渐下降的趋势,‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’果实LAR活性始终大于‘赤霞珠’自根苗果实,‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’果实LAR活性最强;果皮和果肉中LAR相对表达量总体呈现下降趋势,果肉中LAR相对表达量极小,果皮中LAR表达量显著高于果肉,‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’果皮和果肉中LAR相对表达量均大于‘赤霞珠’自根苗和‘5BB’嫁接‘赤霞珠’,其中‘101-14MG’嫁接苗显著大于自根苗。

茶树单体和聚合态儿茶素生物合成的研究进展

儿茶素类化合物,主要包括单体儿茶素和聚合态儿茶素,是茶树(Camellia sinensis)多酚主要组成部分,是绿茶"茶味"决定性成分。茶树儿茶素类化合物合成与积累具有显著的组织器官特异性,鲜叶中主要积累单体儿茶素,根中以积累聚合态儿茶素为主。类黄酮代谢途径下游的无色花青素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)是决定茶树儿茶素类化合物类型的关键酶类。本文主要综述了茶树儿茶素类化合物合成、积累、转录调控研究进展,重点关注LAR、ANR以及无色花青素双加氧酶(LODX)功能和基因转录调控的最新研究进展,并对儿茶素合成途径待解决问题提出了自己的观点。

3种果肉颜色桃原花青素积累

以瑞光19号(白肉)、浙金3号(黄肉)、红肉大红袍(DBF-基因型,红肉)桃果实为试验材料,研究了3种果肉颜色的桃原花青素积累动态及其机制。结果表明,在果实发育过程中,3种不同肉色的桃原花青素含量和积累趋势差异明显。白肉桃和黄肉桃中原花青素积累都伴随着果实成熟而降低;DBF-基因型红肉桃则恰好相反,含量随果实发育急剧升高,成熟时达到最高。无色花青素还原酶(LAR)、花青素还原酶(ANR)的酶活力及其编码基因在转录水平的表达量,分别在3种肉色桃中与原花青素积累趋势一致;在白肉桃和黄肉桃中,LAR与原花青素的积累更为密切;而在红肉桃中,ANR与原花青素的积累更为密切。

不同植物无色花青素还原酶及其基因的生物信息学分析

对9种不同植物的无色花青素还原酶及其基因进行生物信息学分析,探索该蛋白的结构并预测LAR的功能。通过生物信息学软件对Gen Bank中已经登录的不同植物LAR基因和氨基酸序列进行分析,对其组成成分、理化性质、翻译后修饰位点、功能域、二级结构、亚细胞定位、分子进化等进行预测和推断。结果表明,9种植物无色花青素还原酶基因全长在1.0~1.2 kb,编码342~391个氨基酸,不具有信号肽;9种植物LAR都具有蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-端肉豆蔻酰化位点,个别植物LAR具有N-端糖基化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点和c AMP和c GMP依赖蛋白激酶磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;进化分析表明禾本科的玉米与其他科植物亲缘关系较远。

血人参原花青素合成关键酶基因IsANR、IsLAR的鉴定及分析

花青素还原酶(ANR)及无色花青素还原酶(LAR)是原花青素单体生物合成过程中两个关键限速酶,对原花青素的生物合成及积累具有重要作用。本研究以黔产血人参为材料,根据其转录组测序结果,采用生物信息学方法从数据库中鉴定IsANR和IsLAR基因,并分析其蛋白结构及表达模式,揭示其与血人参原花青素积累的关系。本研究从血人参中鉴定出了2个IsANRs、2个IsLARs基因,其中IsLAR1蛋白的氮端具有叶绿体转运体。IsANR2基因的编码区中存在终止子,导致蛋白翻译提前终止。二级结构分析揭示IsANR1比IsANR2有较高比例的α-螺旋,较低的无规卷曲,IsLAR1比IsLAR2有较高的β-转角。IsANR2主要在叶中表达,IsANR1、IsLAR1在血人参根部具有较高的表达量,且IsLAR1和IsLAR2在根中的表达量随年限的增加而上升。因此,血人参根部原花青素的积累可能与LAR基因(尤其是IsLAR1)的上调表达有密切的关系。本研究结果不仅有助于揭示根部原花青素生物的合成机制,同时也为血人参药材的质量控制提供了理论参考。