山丹（lilium pumilum）的组织培养和再生鳞茎的形态解剖学研究

取山丹鳞片，在附加不同激素水平的ＭＳ或ＬＳ培养基上培养，筛选出最适合山丹快速繁殖的培养基（ＭＳ＋ＢＡ＿０．ｓ＋ＮＡＡ＿０．５）．本文观察了再生鳞茎的外部形态，用石蜡切片法研究了愈伤组织和再生鳞茎的解剖结构。结果表明：再生鳞茎在形成后３０ｄ内形态结构正常，但随着培养时间的延长，鳞片上部发育成脆弱的条形叶；叶内细胞一部分解体，在叶肉内形成通气组织。

山丹丹新品种‘延丹1号’的选育

以山丹丹和兰州百合为亲本,培育山丹丹新品种。通过建立山丹丹和兰州百合无性系,诱导愈伤组织。经过原生质体电融合,细胞培养再分化获得的变异植株。通过籽球培养,室内春化、室外栽培等确定变异植株性状。变异植株为无性繁殖,植株长势强壮;花色为橘红色,鳞片环抱紧密,抗旱、抗寒性强,耐贫瘠,无明显病虫害。通过在延安市宝塔区、子长市高柏山、宜川县集义镇连续3年以上测试,发现品种稳定性好、异株率低、复花能力强。经过简化基因组分析‘延丹1号’含有山丹丹和兰州百合的基因,确定通过细胞融合培育获得了山丹丹新品种。

Demethylbelamcandaquinone B from Marantodes pumilum var.alata(Blume)Kuntze inhibits osteoclast differentiation in RAW264.7 cells

Objective:To investigate the bone-resorbing effect of demethylbelamcandaquinone B(Dmcq B)extracted from Marantodes pumilum var.alata on osteoclast differentiation in RAW264.7 cells.Methods:RAW264.7 macrophages were differentiated using RANKL into osteoclast-like cells.Then,they were treated with 10μg/mL Marantodes pumilum var.alata crude aqueous extract,5μg/mL dichloromethane fraction,and 0.6μg/mL Dmcq B and 0.06μg/mL estradiol.Tartrate-resistant acid phosphatase 5b(TRACP 5b)as an osteoclast phenotypic marker was determined by TRACP staining and TRACP 5b colometric assay,and bone-resorbing pits were examined.The gene expression of pro-inflammatory cytokines(TNF-αand IL-6)was measured.Moreover,the protein expressions of pro-inflammatory cytokines(TNF-αand IL-6)and estrogen receptors were evaluated.Results:Marantodes pumilum var.alata crude aqueous extract and Dmcq B inhibited RANKL-stimulated osteoclast differentiation as evidenced by size reduction of giant multinucleated osteoclast cells,decreased TRACP 5b activity as well as the subsiding of resorbed pit area compared with normal control.In addition,they reduced the gene and protein expressions of TNF-αand IL-6.Marantodes pumilum var.alata,Dmcq B,and estradiol treatments increased the protein expressions of estrogen receptors alpha and beta in osteoclasts.Conclusions:Marantodes pumilum var.alata and its active compound,Dmcq B can inhibit osteoclast differentiation.

山丹茎尖玻璃化超低温保存技术体系的建立

为建立山丹(Lilium pumilum DC.)茎尖玻璃化超低温保存技术程序,以山丹无菌苗茎尖为试验材料,采用单因素试验方法,对玻璃化超低温保存技术的关键因素预培养基蔗糖浓度、预培养时间、装载处理时间、PVS2溶液处理时间进行依次筛选。最佳条件为:将茎尖接种于含0.5 mol/L蔗糖的预培养基中预培养7 d,装载处理20 min,PVS2溶液处理80 min后,保存于液氮中即可;可获得70.91%的茎尖存活率和51.85%的再生率,为山丹种质资源提供了简单易行、高效的长期保存方法。

不同授粉方式对山丹与有斑百合种间杂交结实的影响

以内蒙古地区天然分布的山丹(Lilium pumilum var.pumilum)为母本,有斑百合(Lilium concolor var.pulchellum)为父本,采用套硫酸纸袋和锡箔纸包裹柱头两种方式,分析常规授粉、切割柱头授粉、3.5%氯化钾(KCl)涂抹柱头后授粉3种方法对山丹和有斑百合正交结实的影响。结果表明:(1)山丹与有斑百合间不存在严重的杂交障碍,采用锡箔纸包裹柱头的处理方式其坐果率明显优于套硫酸纸袋。(2)采用保留0.5 cm柱头切割法授粉,坐果率最高为31.58%,其次为常规授粉,柱头涂抹KCl后授粉对坐果率没有明显的促进作用;(3)采用锡箔纸包裹柱头、套硫酸纸袋的处理方式对蒴果膨大、种子有胚率无显著性差异,不同授粉方法对蒴果膨大、种子有胚率存在显著差异,其中以保留0.5 cm柱头切割法授粉效果最好,种子有胚率最高可达29.33%。蒴果长/宽越小,其种子有胚率相对越大,可将蒴果的膨大程度作为判断杂交亲和性的外观指标。

不同栽培模式对山丹丹根际土壤细菌群落多样性的影响研究

采集陕西子长市高柏山示范基地山丹丹根际土壤,利用高通量测序技术,分析其细菌群落的多样性及其影响因素。结果表明:共获得细菌有效序列575510条,包含30门90纲147目242科391属。优势菌门为放线菌门(Actinobacteria,38.56%—46.12%)、变形菌门(Proteobacteria,16.67%—26.55%)、绿弯菌门(Chloroflexi,9.45%—18.57%)、酸杆菌门(Acidobacteria,2.96%—5.26%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,2.04%—5.76%)。优势菌纲为放线菌纲(Actinobacteria,32.44%—38.52%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,15.47%—25.89%)、酸杆菌纲(Acidimicrobiia,2.39%—7.59%)、热微菌纲(Thermomicrobia,3.43%—5.55%)和氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria,2.14%—4.29%)。冗余分析显示在属水平上,环境因子可以解释61.86%的细菌群落差异。有机质、速效钾和有效磷是影响山丹丹根际土壤细菌群落组成产生差异的主要环境因素。研究表明,山丹丹根际土壤细菌群落多样性丰富,栽培模式会影响山丹丹根际土壤细菌群落组成产生差异。该研究可为山丹丹菌种资源的进一步开发提供参考。

细叶百合Catalase基因的克隆及表达分析

为探究细叶百合(Lilium pumilum)Catalase(CAT)基因与耐盐碱胁迫的关系,从细叶百合鳞茎中成功克隆出LpCat基因。该基因的ORF区长度为1479 bp,编码492个氨基酸,对其进行序列比对和系统进化树分析,发现细叶百合Catalase蛋白与通江百合(L.sargentiae)、菠萝(Ananas comosus)、油棕(Elaeis guineensis)等植物的Catalase蛋白亲缘关系较近。构建了pQE-LpCat原核表达载体,以1 mol·L^(-1)IPTG为诱导剂进行LpCat蛋白的体外诱导表达与纯化。在添加50 mmol·L^(-1)NaHCO_(3)胁迫下,携带PQE-LpCat蛋白的菌液生长浓度高于对照菌株。在1 mol·L^(-1)NaHCO_(3)、2.5 mol·L^(-1)H_(2)O_(2)胁迫下过表达LpCAT基因烟草(Nicotiana plumbaginifolia)植株与野生型相比,枯萎程度相对较低。通过净光合速率、气孔导度、胞间CO_(2)和蒸腾速率,H_(2)O_(2)含量,丙二醛(MDA)等生理指标检测说明过表达LpCat基因烟草植株比野生型烟草植株更耐盐碱。

细叶百合DREB转录因子生物信息学及胁迫应答表达分析

DREB转录因子是AP2/ERF家族的主要成员,在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用。目前还没有针对细叶百合DREB转录因子家族的系统分析。本研究基于细叶百合(根、茎、叶)转录组数据筛选出12个DREB转录因子,命名为LpDREB1-LpDREB12,并对其进行生物信息学及不同组织在胁迫下的表达模式分析。结果表明,细叶百合DREB蛋白多为不稳定蛋白且具有一定亲水性,α螺旋和无规则卷曲是蛋白二级结构的主要组成部分。系统进化分析显示,12个细叶百合DREB转录因子同61个拟南芥DREB转录因子聚类到一起,说明细叶百合和拟南芥DREB家族成员具有较高的保守性。表达模式分析表明,在干旱、盐、低温及脱落酸胁迫下12个细叶百合DREB基因的表达均有组织特异性。研究结果丰富了细叶百合DREB基因数据库,为挑选优质抗逆基因提供了理论依据。

细叶百合组织培养植株再生

以细叶百合的鳞片和花丝为外植体,通过两种不同的发生方式,成功获得再生植株,并建立了细叶百合两种外植体的再生体系。结果表明:鳞片可以通过器官直接发生途径再生,其最适诱导培养基为MS+NAA0.5mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1;花丝通过愈伤组织间接器官发生途径再生,诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2,4-D2mg·L-1+KT2mg·L-1,诱导愈伤组织产生不定芽的最适培养基为MS+NAA0.5mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1;最适继代增殖培养基均为MS+NAA0.2mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;最适生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg·L-1。

遮荫对细叶百合和松叶百合生长发育及光合色素含量的影响

通过不同程度遮荫处理对细叶百合和松叶百合的生长特性、解剖结构及光合色素含量的变化规律进行研究。结果表明,遮荫条件下两种百合的株高、叶面积、株高/茎粗和叶绿素含量均高于对照;叶干重/叶鲜重比值均低于对照。遮荫处理后细叶百合叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度大于对照,松叶百合则小于对照。

不同居群山丹的核型分析

采用常规压片法对25个居群的山丹（Lilium pumilum DC.）进行了核型分析研究。结果表明：25个山丹居群间的核型存在一定的多样性。各居群山丹均为二倍体种,染色体基数为x=12,根尖细胞中的染色体数目为2n=2x=24。山丹染色体类型有st、sm、t、m、T。最长与最短染色体的比值在1.73-5.90之间,多数在2-4之间;不对称系数介于75.60%-89.60%之间;核型有3A、4A、3B、4B、3C、4C 6种类型,其中以3B类型最多,占60%。

细叶百合的种子萌发

以东北林业大学花圃内栽培的 2年、3年生细叶百合以及大庆野生细叶百合种子为材料 ,观察百合当年种子和隔年陈种子在不同光照强度和不同温度条件下的萌发情况。实验结果表明 ,栽培 2年的细叶百合种子适合萌发的温度为 2 0℃ ,种子萌发对光反应不敏感 ,1 5、2 5℃抑制种子萌发 ;栽培 3年的细叶百合种子适合萌发的条件为 2 0℃恒温、2 4h光照 ,光照强度与种子萌发完全所需时间成反比 ;野生细叶百合种子适合萌发的温度为2 0℃ ,光对种子萌发有抑制作用 ;隔年陈种子萌发率没有下降 ,2 5℃时萌发率最高 ,弱光能提高种子萌发率。细叶百合从野生到栽培 ,光对种子萌发从一定程度的抑制 。

细叶百合低温解除休眠过程中鳞茎细胞淀粉粒及花芽分化的变化

以细叶百合为试材，通过低温（5℃）解除鳞茎休眠，研究了休眠解除过程中鳞茎细胞的淀粉粒的变化及细叶百合花芽分化的变化过程。通过石蜡切片和实体显微结构观察，结果表明，低温冷藏期间，顶芽生长锥的高度和宽度逐渐增加，细叶百合花芽分化主要分为4个时期，O～48d为小花原基分化期，60d为外轮花被原基分化期，72d为内轮花被原基分化期，84d为雄蕊和雌蕊原基分化期；鳞片及顶芽细胞内淀粉粒数量随着冷藏时间的延长逐渐减少。冷藏O～24d内，鳞茎细胞没有进行有丝分裂，冷藏36d以后细胞分裂数量逐渐增加，冷藏84d分裂期细胞数量增加到2．6个。

细叶百合的生物量和营养分配

以栽培的 2年生细叶百合 (Liliumpumilum)为材料 ,于 2 0 0 0年的生长季从蕾期至种子成熟期进行 6次取样 ,对其各器官生物量和氮、磷元素的配置进行了动态研究。结果表明 ,细叶百合虽然以种子繁殖为主 ,但在整个生长季用于生殖器官的生物量投资的比例并不很大 ,大量干物质分配到地下器官鳞茎中 (平均为 6 0 .17% ) ;茎、叶的生物量分配比例仅次于鳞茎 ;雄蕊生物量分配比例明显高于雌蕊。在叶萌动及展叶初期植株全氮百分含量最高 ;从春季萌动至秋季果实成熟 ,叶中的氮呈逐渐递减的趋势 ;茎和生殖器官的全氮含量在蕾期最大 ;生殖器官与叶、鳞茎的全氮含量相关显著。磷在生殖器官的含量较高 ,这与磷在植物有性生殖过程中的重要作用相一致 ;生殖器官与茎的全磷含量相关显著。地下器官全氮、全磷随季节变化有增多的趋势 ;地上各器官全氮、全磷相关显著 。

细叶百合冷藏过程中鳞茎保护酶活性与休眠解除的关系

以细叶百合为试材,通过冷藏（5℃）解除鳞茎休眠,研究了细叶百合鳞茎解除休眠过程中鳞茎保护酶活性与糖代谢的变化规律.结果表明,鳞片、顶芽及鳞茎盘SOD 活性在冷藏0～24d内下降,除顶芽外,鳞茎各部位POD活性在0～24d内呈下降趋势,外鳞片、顶芽及鳞茎盘中CAT 活性在冷藏0～12d 内下降,冷藏中后期,SOD、CAT、ASP 活性升高,鳞片中POD 的活性下降,顶芽及鳞茎盘POD、PPO 在冷藏中期上升.各种代谢相关酶在不同器官中的作用并不完全相同.在低温处理36～60d内,ASP、CAT 活性快速上升,后期趋于稳定.SOD 活性最低点出现在冷藏36～60d,鳞茎各部位淀粉与CAT、PPO、ASP均表现为负相关性,SOD、POD、PAL 与鳞片中淀粉表现为正相关性.36d是鳞茎解除休眠的起点,60d时鳞茎基本解除休眠.

山丹启动培养中生理生化特性的研究

研究了山丹百合鳞茎不同部位鳞片在启动培养过程中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白质、游离氨基酸等几种内含物及POD、SOD酶活性的变化,探讨组培过程中内在生理生化的变化规律与百合离体再生培养器官分化之间的关系,结果表明:山丹启动培养中POD、SOD的酶活性的高低与外植体分化率的大小有一定的相关性。可溶性糖、可溶性蛋白质和淀粉在外植体启动培养初期主要被用于提供分化所需养分,其含量的高低与组织分化率关系不很明显。

HPLC法测定百合、卷丹、细叶百合中3种甾体皂苷的含量

目的 HPLC法同时测定百合、卷丹、细叶百合中3种甾体皂苷的含量。方法采用HPLC法,色谱柱为Akzonobel Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸,检测波长210 nm,流速1.0mL/min。结果 (25R)-26-O-(β-D-吡喃葡萄糖)-呋甾烷-5-烯-3β,22R,26-三羟基-3-O-α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称皂苷1)在2～12μg呈良好线性关系(r=0.9998);(25R)-螺甾烷-5-烯-3β-O-α-L-鼠李糖-(1→2)-O-[β-D-葡萄糖-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称皂苷2)在3.125～18.75μg呈良好线性关系(r=0.9999);(25R)-3β,17α-二羟基-5α-螺甾烷-6-酮-3-O-α-L-鼠李糖-(l→2)-O-[α-L-阿拉伯糖-(l→3)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称皂苷3)在1.125～9μg呈良好线性关系(r=0.9997)。皂苷1、2、3的平均回收率分别为97.72%、99.27%、98.96%,RSD分别为1.96%、1.78%、1.31%。结论所建立的HPLC法简便快速、准确度高,可用于百合药材的质量控制。

细叶百合鳞茎花芽分化过程观察

以细叶百合（Lilium pumilum）鳞茎为试材,利用石蜡切片和扫描电子显微技术,对细叶百合鳞茎花芽分化全过程进行形态学和组织细胞学观察,研究细叶百合鳞茎在自然越冬状态下花芽的发生、发育进程。结果表明,细叶百合鳞茎芽顶端生长点9月中旬开始由营养茎端向生殖茎端转变,11月中旬封冻前,芽顶端生长点最下面1～2个小花原基已完成花被原基的分化,翌年春季解冻后,继续进行花芽分化,至5月中旬前,整个花序分化完成。整个花序分化历时8个月左右,形成4～7个花蕾,并可将百合花芽分化划分为未分化期、分化初期、小花原基分化期、花被原基分化期、雄蕊和雌蕊原基分化期、整个花序形成期6个时期。

蕙兰×台兰种间杂交种子无菌播种育苗技术研究

以蕙兰×台兰种间杂交的种子为材料，研究适合于种子无菌播种、原球茎分化芽、生根壮苗的不同培养基．结果表明：在５种用于无菌播种的培养基中，添加ＩＡＡ１０ｍｇ／Ｌ的Ｃ１培养基，种子萌动率达３％，原球茎由培养１２０天的１０．１３个／瓶，平均直径１．６３ｍｍ到２２０天增至１９．８６个／瓶，平均直径４．３０ｍｍ；ＢＡ１～２ｍｇ／Ｌ有利于原球茎分化芽，分化率达１００％以上；ＮＡＡ２ｍｇ／Ｌ使生根壮苗率达１００％．添加活性炭１．５～３ｇ／Ｌ对种子成苗过程效果较好，在芽分化与生根壮苗培养中，减少ＭＳ大量元素的使用量有利于生长．兰花试管苗移栽成活率为８０％，已获得４～５年生的杂种苗．

不同山丹居群在保定的生长特性分析

对25个居群的山丹在保定地区的物候期、生长期特性进行了调查分析。结果表明,不同山丹居群的物候期存在明显差异。萌芽期和开花期最早的为辽宁居群,最晚的为易县和邯郸居群,萌芽期相差37～39 d,开花期相差将近3个月。25个居群的不同生长发育阶段(花蕾发育期、花期天数、生长周期)所需的时间长短不一。不同居群山丹生长曲线基本一致,均为慢-快-慢的生长趋势。相关分析表明纬度与山丹的萌芽期、现蕾期、始花期、末花期、果熟期、枯萎期之间均呈极显著负相关。山丹的自然物候期也存在明显早、晚差异,这为百合育种提供了良好的资源。