慢性粒细胞性白血病患者骨髓源bcr/abl融合基因阳性Flk1^+CD31^-CD34^-干细胞体外抗STI571机制的初步研究

为进一步了解STI571对慢性粒细胞性白血病(CML)患者体内bcr/abl融合基因阳性的原始及定向白血病干/祖细胞分化及增殖的影响,更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对STI571的耐药机制,利用从CML患者骨髓分离到的具有血管母细胞特性、bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞,体外检测了STI571对其在造血集落培养基中的分化及处于分化阶段时的增殖抑制作用。结果显示:浓度为5μmol/LSTI571,维持作用96小时(病人体内维持96小时的STI571浓度只可能达到1-2μmol/L),即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖。没有充分的证据显示,相对原始的bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞的分化及增殖受到明显的抑制作用。结论:CML患者体内的原始白血病干/祖细胞对STI571具有一定的抗性,临床上所观察到的CML患者在运用STI571一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为STI571杀死或抑制了定向恶性白血病祖细胞的增殖,但随着时间的推移,在经历了短暂的血液学甚至是细胞遗传学水平上的缓解后,对STI571耐药的原始白血病干/祖细胞终究会再次导致CML的复发。

胎儿骨髓来源的Flk1^+CD34^-细胞的血液血管干细胞特性

目的研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法分离并培养人胎儿骨髓基质细胞(hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表型。将此细胞接种在基底膜胶中,由血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导,免疫组化和透射电镜检测血管和造血的分化形成。结果此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99%表达Flk1(即血管内皮细胞生长因子受体2),并能形成血管样结构,而在管样结构形成的过程中诱导出CD34阳性的圆形细胞。结论Flk1+CD34-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化,提示其具有血液血管干细胞的特征表型。

白藜芦醇对CD34^+CD38^- KG-1a白血病细胞凋亡的诱导作用

目的观察白藜芦醇(RES)诱导CD34+CD38-KG-1a白血病细胞凋亡的效应,初步探讨其作用机制。方法流式细胞术检测急性髓系白血病KG-1a细胞CD34和CD38的表达。以未加药物为对照,台盼蓝计数检测不同浓度(12.5、25.0、50.0、100、200μmol/L)RES对KG-1a细胞和外周血单个核细胞增殖的影响。选择KG-1a细胞抑制率约为50%的RES浓度作为后续实验的干预因素。AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞术检测RES诱导KG-1a细胞的凋亡效应,real-time RT-PCR检测RES对KG-1a白血病细胞Bcl家族抗凋亡Bcl-2/Bcl-xl基因和促凋亡基因Bid/Bax表达的影响,分光光度法检测RES对KG-1a细胞Caspase-3活性的影响。结果 KG-1a细胞中CD34+CD38-细胞比例占(90.23±2.57)%。RES能抑制KG-1a白血病细胞生长,呈浓度依赖性。25.0μmol/L RES对KG-1a细胞的抑制率约为50%,而该浓度对正常单个核细胞增殖无抑制作用。25.0μmol/L RES能诱导KG-1a细胞发生早期凋亡(AnnexinV-FITC+PI-)和晚期凋亡(AnnexinV-FITC+PI+)。25.0μmol/L RES作用后的KG-1a细胞,抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl表达下调,促凋亡基因Bid和Bax表达升高,Caspase-3活性增强。结论 RES能调节Bcl-2家族,诱导CD34+CD38-KG-1a白血病细胞凋亡。

造血干细胞的两种形式:CD34^+和CD34^-

造血干细胞 (HSC)的表面标记是对HSC进行深入研究的关键 ,CD34抗原是一公认的指标 ,但近来大量的资料表明尚存在CD34- 的干细胞 ,两种形式HSC共存还是CD34细胞源于CD34- 细胞引起了很大争议 ,本文对此作一综述。

脐血CD34^+CD38^-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡

为了从适龄产妇脐血中分离出CD34+CD38-细胞,在体外较长时间培养后观察分析CD34+CD38-细胞分 裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34+CD38-细胞增殖的影响,用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出 CD34+和CD38-标记的脐血原始细胞,在添加IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、IGF-1和SCF 6种混合因子的干细胞培养基 中培养6个月,观察细胞并绘制生长曲线,用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34+CD38-细胞生长的影响和 用流式细胞仪检测CD34+ CD38-细胞凋亡情况。结果表明:脐血CD34+CD38-细胞可在体外较长时间培养增殖, 无异常或过度的细胞凋亡发生。结论:通过控制培养条件,脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞可在体外较长时间 培养增殖,以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源。

microRNA在人脐血CD34^+CD38^-、CD34^+CD38^+细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA(miRNA)在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞(MNC),应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34+CD38+细胞的表达水平比在CD34+CD38-细胞的表达水平降低至1/2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为"干细胞性"miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个(14.29%,12/84)相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论:"干细胞性"miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式→造血干/祖细胞基因表达谱→造血干/祖细胞的自我更新和系列定向分化。

CD34^-造血干细胞的研究进展

造血干细胞(HSCs)的表型一直是研究的重要课题。一般认为:CD34^+是骨髓HSCs的标志之一。但近年研究发现:存在一CD34^- HSCs群,它能长期重建造血并可分化为CD34^+细胞,可能是CD34^+细胞的前身细胞。本文对CD34^- HSCs从发现、含量、表面分子表达、体外体内生物学特性及体外培养扩增条件方面的研究进展等作一综述。

t(8;21)急性髓系白血病CD34^-白血病干细胞的确认和特征的体外研究

目的:通过体外实验初步确定t(8;21)急性髓系白血病(AML)中CD34^-白血病干细胞(LSC)的存在。方法:检测初诊t(8;21)AML骨髓样本,在荧光抗体标记后利用流式细胞仪分选出3个细胞群:Lin^-CD34^+CD38^-(简称为CD34^+CD38^-)、Lin^-CD34^+CD38^+(简称为CD34^+CD38^+)及Lin^-CD34^-CD38^-CD45^(dim)SSC^(low)(简称为CD34^-"LSC")。通过Hochest 33342和派洛宁Y(PY)双染色及乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测实验比较各细胞群G_0期细胞和ALDH^(br)细胞比例。分选各细胞群后采用实时定量PCR技术检测AML1-ETO和WT1 mRNA水平。结果:检测3例患者的G0期细胞比例均为CD34^-"LSC">CD34^+ CD38^->CD34^+ CD38^+。配对t检验显示,53例检测的患者CD34^-"LSC"及CD34^+CD38^-中ALDH^(br)细胞比例均显著高于CD34^+ CD38^+中(P=0.0004,P<0.0001),并且CD34^-"LSC"中ALDH^(br)细胞比例显著高于CD34^+ CD38^-(P=0.003)。3例分选的患者的3群细胞之间AML1-ETO mRNA水平相似,而CD34^-"LSC"的WT1 mRNA水平均明显高于另2个细胞群。结论:t(8;21)AML骨髓CD34^-细胞群可能含有LSC,并且可能比CD34^+ CD38^-更原始。

慢性髓系白血病患者CD34^+ CD38^-细胞水平JunB和CDH13基因启动子区域的甲基化状态研究

慢性髓系白血病(CML)是骨髓造血干细胞恶性增殖的克隆性疾病,在CML患者细胞水平由于JunB和CDH13基因启动子区甲基化而使这2个抑癌基因的表达受损。为了探讨正常人和CML患者CD34+ CD38-细胞水平JunB和CDH13(cadhe rin-13)基因启动子区域甲基化状态及表达水平的差异,应用流式细胞仪分选出CD34+ CD38-细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测5例正常人和8例CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞JunB和CDH13基因启动子区域甲基化状态,用实时定量PCR(RT-PCR)检测JunB和CDH13基因的表达情况。结果表明:JUNB和CDH13基因在正常人骨髓CD34+ CD38-细胞中呈完全性非甲基化状态,CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞中JunB和CDH13基因启动子区甲基化比例分别为87.5%(7/8)和50%(4/8),明显高于正常人(p<0.05)。CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞中JunB和CDH13基因mRNA相对表达水平与正常人的相比明显降低(2-??CT分别为1/5.21和1/10.63)。结论:在CML患者骨髓CD34+ CD38-细胞中JunB和CDH13基因启动子区域都发生了高度的甲基化,它们的mRNA表达水平也明显降低,JunB和CDH13基因启动子区域甲基化在CML的发病机制中起到一定的作用,甲基化检测对CML的靶向治疗及新的治疗方法具有重要意义。

人CD34^+和CD34^-细胞在NOD/SCID小鼠体内的造血重建

利用非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠模型,比较了新鲜及培养后的CD34+和CD34-细胞在体内植入及重建造血能力。从新鲜脐血及培养后的单个核细胞(MNC)中分离出CD34+和CD34-细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内,6周后处死存活的小鼠,取其骨髓、脾脏和外周血细胞,分别进行细胞表型分析、造血集落形成单位和人特异性基因的检测。经检测,输注CD34+细胞和混合细胞的小鼠,其体内CD45+细胞及人源各系血细胞的含量相近,两者均远远高于输注CD34-细胞的小鼠。输注培养后CD34-细胞的小鼠饲养6周后全部死亡,输注培养后CD34+细胞的小鼠存活率约为66.7%,而输注培养后混合细胞的小鼠全部存活,且在两组存活的小鼠体内均能检测到CD45+细胞及人源各系血细胞。结果表明:无论是新鲜还是培养后的CD34+细胞均具有在NOD/SCID小鼠体内植入和重建造血能力,而CD34-细胞不具有该能力,但CD34-细胞与CD34+细胞同时输注有助于提高小鼠的存活率,说明其对CD34+细胞在小鼠体内发挥植入和造血重建能力有一定的辅助作用。

脐带间充质干细胞体外调节CD34^+CD126^-细胞向巨核系诱导的研究

目的:研究CD34+CD126-细胞向巨核细胞诱导分化及间充质干细胞对诱导过程的调节。方法:免疫磁珠分选获得CD34+CD126-细胞,设置3个实验组:无间充质组、间充质直接接触组和非直接接触组,以脐带血单个核细胞作对照,诱导向巨核细胞分化14 d,分别在7 d末与14 d末进行悬浮细胞数计数,流式测定CD34与CD41表型及镜下细胞形态观察。胶原蛋白凝胶培养基诱导CD34+CD126-细胞形成巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk),12 d末CD41特异性抗原染色并镜下计数CFU-Mk。结果:(1)诱导7 d或14 d末,间充质组(CD34+CD126-细胞与MSC接触或非接触共培养组)获得悬浮细胞数均显著高于无间充质组(均为P<0.001),但MSC接触与非接触组间获得悬浮细胞数差异无统计学意义(P>0.05);(2)诱导7 d末,间充质组CD34阳性细胞数均显著大于无间充质组(均为P<0.001),MSC接触组CD34阳性细胞数显著小于非接触组(P<0.05),诱导14 d末,各组CD34阳性细胞率均下降至2%左右;(3)诱导7 d或14 d末,间充质组CD41阳性细胞数均显著大于无间充质组(均为P<0.001),而MSC接触与非接触组间CD41阳性细胞数均无显著性差异(P>0.05),CD34+CD126-细胞各组CD41阳性数均显著大于CBMCs的对应各组(均为P<0.001);(4)CD34+CD126-细胞组诱导得到的大CFU-Mk(≥50个细胞)与中CFU-Mk(21~49个细胞)数量显著大于CBMCs组(PCFU-Mk;≥50 cells<0.01,PCFU-Mk;21-49 cells<0.05)。结论:脐带间充质干细胞的旁分泌作用对于巨核细胞分化过程中CD34+细胞或CD41+细胞的增殖均具有促进作用,但MSC的微环境能显著降低CD34+细胞的增殖速率。诱导前筛选较为原始的巨核细胞祖细胞作为起始细胞对于巨核细胞诱导效率的提升具有显著作用。

Lin^-CD_(34)^-与Lin^-CD_(34)^+细胞差异表达基因的鉴定

目的 克隆并鉴定Lin-CD3 4-细胞区别于Lin-CD3 4+细胞的可能与其性状相关的基因。方法 以Lin-CD3 4-细胞作为检测对象 ,Lin-CD3 4+细胞作为驱动细胞 ,应用抑制消减杂交技术构建Lin-CD3 4-细胞的cDNA消减文库。选取部分克隆测序 ,测序结果与GenBank进行同源性比较和功能分析。结果 共获得 593个含有插入片段的克隆 ,片段的长度为 30 0～ 50 0bp。随机选取 53条EST进行测序 ,其中 37条EST代表了 1 0个已知基因 ,其余 1 6条EST代表了 4个未知序列。结论 利用抑制消减杂交技术鉴定出部分Lin-CD3 4-细胞特异表达的基因 ,可能与Lin-CD3

流式细胞检测术分析胎肝CD_(34)^+细胞成分

目的 了解胎肝中CD3 4 + CD3 8+ 和CD3 4 + CD3 8-细胞数量组成。方法 从胎肝中分离细胞 ,制成细胞悬液 ;经淋巴细胞分离液密度梯度离心 ,收集单个核细胞 ;洗涤两次 ,制备细胞母液 ;取约 1× 10 6细胞经CD3 4 CD3 8荧光抗体标记 ,流式细胞仪检测CD3 4 + CD3 8+ 和CD3 4 + CD3 8-细胞含量 ;用红细胞裂解液裂解残留在MNCs中的红细胞 ,统计肝细胞中MNCs的相对总数 ,最终统计出胎肝中CD3 4 + 和CD3 4 + CD3 8-细胞的相对数量。结果 2 2～ 30W胎龄胎肝MNC中CD3 4 + 细胞平均为 12 .0 2 %± 4 .0 0 % ,CD3 4 + CD3 8-细胞平均为 6 .17%± 5 .0 8% ,CD3 4 + CD3 8-细胞在CD3 4 + 细胞中约占 5 1.0 0 %± 32 .5 6 % ;该期胎肝组织中CD3 4 + 细胞和CD3 4 + CD3 8-细胞相对总数和胎龄有一定的相关性 ,30W时明显高于 2 2W。结论 2 2～ 30W胎龄胎肝中的CD3 4 + 细胞和CD3 4 + CD3 8-细胞相对百分率都高于胎儿脐血、新生儿脐血、成人骨髓和外周血的百分率 ;CD3 4 + CD3 8-细胞在CD3 4 +

免疫磁珠分选系统在急性髓系白血病干细胞分离中的应用

目的:采用免疫磁珠分选系统(MACS)分离人白血病骨髓CD34+、CD38-干细胞群。方法:收集人白血病骨髓,Percoll密度梯度离心分离单个核细胞,CD34、38磁性标记,MACS分离纯化CD34+、CD38-干细胞群,流式细胞仪检测其纯度和分选前后CD34+、CD38-百分比,计算回收率。结果:分选后的CD34+、CD38-细胞纯度达72.6±3.2%,回收率85.8±1.2%。结论:免疫磁珠分选系统是一种有效的白血病干细胞分离提纯方法,所得细胞纯度比较高。

人脐血CD34^+ CD38^-细胞免疫表型和染色体核型特征分析

目的分离脐血干/祖细胞(CD34+CD38-)进行体外长期培养,观察分析其增殖、细胞表面分子标志和染色体核型的特征。方法用流式细胞仪分选CD34FITC和CD38PE标记的CD34+CD38-脐血原始细胞,在含细胞生长因子IL3、IL6、GMCSF、EPO、SCF和胰岛素样生长因子的干细胞培养基中培养6个月,用流式细胞术检测体外培养30d的干/祖细胞表面标记,并用G显带方法分析其染色体核型。结果在一定培养条件下,经7～12d培养,脐血干/祖细胞(CD34+CD38-)开始增殖。培养6个月后,每孔接种1个细胞,细胞数增殖至250～350个;每孔接种10个细胞,细胞数可增殖至400～500个。每孔接种1个细胞其细胞增殖峰持续时间(8～9代)比接种10个细胞(6～7代)长。经体外长期培养增殖,细胞仍强烈显示干/祖细胞表面分子标记(CD34+CD38-);细胞染色体数目、结构未见异常。结论脐血干/祖细胞(CD34+CD38-)经体外特异性培养增殖,可为大量脐血干/祖细胞移植提供细胞来源。

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外是否可定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法采用梯度离心法,分离纯化SD大鼠的MSCs,流式细胞仪检测和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。根据培养基中肝细胞生长因子(HGF)浓度不同,将MSCs分为4组进行诱导分化:A组0ng/ml,B组10ng/ml,C组20ng/ml,D组40ng/ml。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的1,3,7,14,21,28d,分别以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和细胞免疫组化检测各组细胞甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)和白蛋白的基因和蛋白表达。结果分离纯化的SD大鼠MSCs的表面标志为CD29+,CD44+,CD34-,CD45-和CD90+,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98%以上。C组与D组的MSCs,于培养第7天出现AFP基因表达,第14天表达增强,第28天表达减弱;第14天始出现白蛋白、CK18基因表达,而后持续。B组和A组在培养过程中,未出现AFP、CK18和白蛋白的表达。C组与D组MSCs的AFP细胞免疫组化染色培养第7天即出现阳性,第14天白蛋白和CK18免疫组化染色阳性。A组和B组的MSCs的AFP、白蛋白和CK18的免疫组化染色均阴性。结论成年大鼠MSCs在较高浓度的HGF的诱导下,可分化为肝细胞。