汉黄芩素上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达

[目的]探讨汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞增殖、分化、迁移、黏附关键功能基因表达的影响。[方法]采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞,采用CD117作为标志进行细胞鉴定。应用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)芯片技术研究汉黄芩素对小鼠骨髓Lin-细胞功能基因表达的影响。采用黏附能力测定实验观察Lin-细胞的黏附能力。[结果]流式细胞技术结果显示,小鼠骨髓源性单个核细胞免疫磁珠分选后CD117的阳性率为93.7%;芯片结果发现汉黄芩素明显上调Lin-细胞血小板内皮细胞黏附分子-1(Pecam1)基因表达;黏附能力测定实验结果可见汉黄芩素增强Lin-细胞的黏附能力。[结论]免疫磁珠法分离小鼠骨髓Lin-细胞是一种较为理想的分离方法;汉黄芩素可能通过上调小鼠骨髓Lin-细胞Pecam1基因表达,从而增加Lin-细胞的黏附能力。

小鼠c-Kit^+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的评价小鼠c-Kit+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能,为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法供体为纯系BALB/C雄性小鼠,c-Kit+Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB/C雌性小鼠,立即移植供体c-Kit+lin-骨髓细胞。接受c-Kit+lin-骨髓细胞移植1月后,活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常,肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论小鼠c-Kit+Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能,移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。

CDC50A在宫颈癌原代细胞中的表达及对干细胞特性的影响

目的:探讨人宫颈癌原代细胞的分离、培养、鉴定方法以及细胞周期蛋白50A(CDC50A)对其生物学特性的维持作用。方法:收集2017年1月~2018年2月期间在妇科进行宫颈手术的24例宫颈癌患者和10例行子宫全切术患者的宫颈组织标本;采用蛋白酶消化法分离宫颈癌组织,通过原代培养、流式细胞术分选法将宫颈癌原代细胞分为CDC50A^(+)Lin^(-)细胞组,CDC50A-Lin^(-)细胞组,采用MTT法测定各表型细胞体外增殖活性以及体内成瘤能力;采用端粒重复扩增法(TRAP)结合电泳及银染法测定端粒酶活性。结果:①宫颈癌原代细胞表型CDC50A^(+)Lin^(-)的细胞仅占0.95%~5.64%;且宫颈癌组织中CDC50A阳性表达率为87.5%,明显高于正常宫颈黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.05);②CDC50A^(+)Lin^(-)细胞体外增殖活性以及集落形成能力明显高于CDC50A-Lin^(-)细胞和未分选细胞,差异有统计学意义(P<0.05);③裸鼠皮下接种CDC50A^(+)Lin^(-)细胞,2周就可观察到明显的新生肿瘤块,成瘤率明显高于接种CDC50A-Lin^(-)细胞和未分选细胞,差异有统计学意义(P<0.05);④CDC50A^(+)Lin^(-)细胞端粒酶相对表达强度为显著高于对照组细胞和CDC50A-Lin^(-)细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CDC50A有可能是分选人宫颈癌干细胞的表面标志物,CDC50A^(+)Lin^(-)细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性。

白细胞介素3与c-kit~＋Lin^-细胞的增殖

背景:c-kit+Lin-即为骨髓衍生肝干细胞,与其他造血干细胞类似,c-kit+Lin-细胞的数量有限,难以满足科研的需要。目的:观察在无血清无基质的条件下,白细胞介素3和因子组合对扩增c-kit+Lin-细胞的影响。方法:采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,在干细胞因子、肝细胞生长因子、FLt-3配基、促血小板生成素和白血病抑制因子组合中添加不同剂量的白细胞介素3培养7d,检测细胞总数、c-kit+Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率。结果与结论:各因子组均可显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数7~19倍不等。随白细胞介素3剂量加大,虽然细胞总数上升,但是超过一定浓度后c-kit+Lin-细胞扩增反而不明显。40μg/L白细胞介素3组细胞总数扩增245.41倍,但c-kit+Lin-细胞扩增仅为15.80倍,与20μg/L白细胞介素3组差异有显著性意义(P<0.05)。但40μg/L白细胞介素3组细胞凋亡率最低,仅为4.66%。提示白细胞介素3能协同干细胞因子+肝细胞生长因子+FLt-3配基+促血小板生成素+白血病抑制因子有效地扩增c-kit+Lin-细胞,其表型并不受影响,但过高剂量反而促使干细胞分化。20μg/L剂量的白细胞介素3扩增效果最佳。

小鼠Hes1基因过表达逆转录病毒载体的构建及其在小鼠Lin^-造血细胞中的表达

目的构建过表达Hes1基因的逆转录病毒载体,并通过感染相对原始的小鼠Lin-造血细胞检测其感染效率。方法通过RT-PCR法从B6小鼠骨髓细胞中扩增Hes1基因功能区,将扩增产物连接入逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP,瞬时转染293T细胞,设转染空载体的细胞为对照组,流式细胞仪检测转染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达;将重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP及空载体与Lipofectamine 2000混合后,转染293T细胞,包装重组逆转录病毒,稳定感染小鼠Lin-细胞,设感染空载体病毒的细胞为对照组,流式细胞仪检测感染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达。结果测序证实重组逆转录病毒载体构建正确;转染293T细胞后第3天,重组逆转录病毒的转染效率约为95%,Hes1基因表达量约为对照组的5倍;病毒上清感染Lin-细胞后第4、5天,重组逆转录病毒的感染效率约为7%,Hes1基因的表达量约为对照组的6倍。结论已成功构建了过表达Hes1基因的重组逆转录病毒载体,并在小鼠Lin-细胞中稳定表达,为研究白血病环境下Hes1对造血干祖细胞的作用奠定了基础。

c-Kit^+ Lin^- 细胞体外扩增及体内分化的实验研究

目的研究移植刚分选及扩增后雄性小鼠的骨髓c-Kit+Lin-细胞到酒精性肝纤维化雌性模型小鼠体内后,模型小鼠的肝脏形态改变、肝功能变化和移植细胞的分布、分化及归巢情况。方法采用酒精灌胃法建立酒精性肝纤维化雌性小鼠模型,造模成功后随机选取8只模型小鼠(模型组)与正常小鼠8只(对照组)比较两组肝功能变化。剩余模型小鼠再随机选取32只,分为4组处理,并再随机选取8只正常小鼠(第1组)与其对照。模型小鼠的4组分别为:移植前取血处死组(第2组),移植新鲜分选的c-Kit+Lin-细胞组(第3组),移植扩增后的cKit+Lin-细胞组(第4组),仅予以注射Buffer组(第5组)。采用免疫磁珠法分选雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-细胞;利用SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3因子组合对其进行体外扩增;将刚分选及扩增后c-Kit+Lin-细胞移植入酒精性肝纤维化雌性模型小鼠体内,检测两组肝功能改变、肝脏纤维化改善、含雄性小鼠Y染色体性别决定基因cDNA(Sry)的移植细胞在受体肝内定居分化情况。结果 (1)两移植组在移植30天后,较移植前肝脏纤维化改善明显;(2)两移植组在移植30天后AST、ALT、ALB与移植前比较差异有显著性意义(P<0.05);(3)两移植组均可见含雄性小鼠Y染色体性别决定基因cDNA(Sry)的移植细胞,并同时表达ALB mRNA,计数细胞比例,比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论移植c-Kit+Lin-细胞后能在受体肝内定居并转化成有功能新生肝细胞;移植cKit+Lin-细胞后能明显改善肝损伤小鼠的肝功能及肝脏纤维化;扩增对c-Kit+Lin-细胞的归巢、在体内分化没有明显影响。