Linc00052基因在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探究非小细胞肺癌(NSCLC)组织及其细胞系内基因长链非编码RNA00052(long intergenic non-coding RNA 00052,Linc00052)的表达水平,以及Linc00052在肺癌中的临床意义、作用机制及与患者预后的相关性。方法:利用逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测正常肺细胞系与肺癌细胞系之间Linc00052表达水平的差异,肺癌组织与癌旁组织之间Linc00052表达水平的差异,并分析Linc00052与肺癌临床病理特征的相关性,Kaplan-Meier生存曲线分析Linc00052与肺癌预后之间的相关性。在A549细胞系中过表达Linc00052,采用MTT实验检测过表达Linc00052前后细胞增殖变化,并采用qRT-PCR检测miR-330-3p表达变化。结果:肺癌细胞系较正常肺细胞系中Linc00052明显低表达,同时肺癌组织比癌旁组织中Linc00052明显低表达(P<0.01);Linc00052的表达与肿瘤的分化程度(P=0.02)、淋巴结转移(P=0.002)、远处转移(P=0.005)和临床分期(P=0.001)有关。肺癌的Linc00052表达水平减低与肺癌患者的预后不良有关(P<0.05)。过表达Linc00052后可显著抑制细胞增殖(P<0.05),qRT-PCR结果证实,过表达Linc00052可显著下调miR-330-3p mRNA的表达水平(P<0.05)。结论:Linc00052在肺癌组织中表达下调,并与肺癌的发生发展及预后密切相关,Linc00052有可能通过负调控miR-330-3p在肺癌中发挥抑癌作用。

LINC00052靶向miR-145发挥对TNF-α诱导人关节软骨细胞损伤的保护作用

目的明确长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)LINC00052在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)诱导人关节软骨细胞损伤中的作用,并阐明其对miR-145的调控机制。方法利用0、10及30 ng/mL TNF-α诱导建立人C-20/A4关节软骨细胞损伤模型。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测LINC00052与miR-145的表达及二者的相关性。通过特异性短发夹RNA干扰C-20/A4细胞中LINC00052的表达,采用四唑盐比色法[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]检测细胞增殖能力。采用蛋白质印迹检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、cleaved CASP3、Bcl-2相关X(Bcl-2 associated X,BAX)蛋白的表达水平。采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6及IL-13的浓度。采用双荧光素酶报告基因实验分析LINC00052对miR-145的直接调控作用。采用拯救实验验证LINC00052靶向miR-145在TNF-α诱导C-20/A4细胞损伤中的作用。采用t检验与方差分析进行统计比较。结果LINC00052在0、10及30 ng/mL TNF-α诱导C-20/A4细胞中的表达水平呈上调趋势,而miR-145呈下调趋势,二者表达水平呈负相关(P<0.05)。干扰LINC00052降低TNF-α诱导C-20/A4细胞增殖能力,增加CASP3、cleaved CASP3及BAX的蛋白表达水平,并提高IL-1β、IL-6及IL-13的浓度(P<0.05)。miR-145是LINC00052的直接靶基因,干扰LINC00052上调C-20/A4细胞中miR-145的表达水平(P<0.05)。干扰miR-145部分逆转LINC00052抑制对TNF-α诱导C-20/A4细胞增殖、凋亡及炎症反应的影响(P<0.05)。结论LINC00052靶向miR-145发挥对TNF-α诱导人关节软骨细胞损伤的保护作用,其机制可能与促进增殖并抑制凋亡与炎症反应有关。

LINC00052在甲基丙烯酸环氧丙酯诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中的表达

目的探讨LINC00052在甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化过程中的表达变化及其作用。方法将16HBE细胞分为二甲基亚砜(DMSO)对照组和GMA处理组,收集两组处理后的第10代(P10,前期)、第20代(P20,中期)和第30代(P30,后期)细胞。采用LncRNA芯片分析LINC00052在不同时期的表达改变,借助生物信息学数据库进行靶基因和功能预测,并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测LINC00052和预测靶基因NTRK3的相对表达量。结果芯片结果显示,与对照组比较,LINC00052在转化的P10、P20和P30分别上调1.32倍、下调1.64倍和下调4.92倍。qPCR结果显示,与同期DMSO对照组比较,P10、P20和P30细胞LINC00052的相对表达量分别上调1.55倍、下调1.20倍和下调2.35倍,P10、P30细胞NTRK3的相对表达量分别上调1.37、1.69倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中,LINC00052在转化前期表达量上调,中期、后期表达量下调,并可能通过影响靶基因NTRK3的表达发挥抑癌基因的作用。

LINC00052通过微小RNA-330-3p/RCAN1轴对肝癌细胞增殖和迁移的影响

目的观察LINC00052靶向微小RNA(miRNA,miR)-330-3 p/RCAN1对肝癌增殖和迁移的影响.方法收集正常肝癌组织和癌旁组织各100例,采用荧光定量PCR分析LINC00052和miR-330-3p表达水平.采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析LINC00052和miR-330-3p间的关系以及miR-57的靶基因;在肝癌细胞株MHCC97H中构建LINC00052敲降细胞株和miR-330-3p过表达细胞株,采用EDU法和Transwell实验肝癌细胞的增殖和迁移能力.结果与肝癌癌旁组织LINC00052和miR-330-3p[(1.01±0.21),(1.12±0.21)]比较,肝癌组织LINC00052表达水平(0.41±0.13)显著下降,miR-330-3p表达水平(2.37±0.20)显著下调,差异均有统计学意义(t=3.691、3.110,P<0.05)].生物信息学和双荧光素酶分析显示LINC00052能与miR-330-3p互补结合,miR-330-3p调节着RCAN1蛋白表达.与Linc-contrtol组细胞[(67.43±9.32)、(120.32±11.32)]比较,LINC00052组肝癌细胞的增殖和迁移[(29.44±6.81),(73.41±9.76)]明显抑制,差异均有统计学意义(t=4.198、3.109,P<0.05).与miR-control组[(69.33±10.98)、(130.22.33±13.19)]比较,miR-330-3p KD组肝癌细胞增殖和迁移[(35.32±7.12),(63.39±10.32)]显著抑制,差异均有统计学意义(t=3.091、4.011,P<0.05).与LINC-contrtol组和miR-control组肝癌细胞RCAN1表达水平[(0.51±0.13)、(0.49±0.10)]比较,LINC00052组和miR-330-3p KD组细胞RCAN1蛋白表达水平[(1.23±0.23)、(1.03±0.12)]显著增加,差异有统计学意义(t=4.339、4.211,P<0.05).结论LINC00052通过靶向作用于miR-330-3p/RCAN1进而调节着肝癌细胞的增殖和迁移.

LINC00052靶向miR-148b-3p影响高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡及EMT的分子机制

目的 探讨LINC00052通过靶向miR-148b-3p影响高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡及上皮间质转化(EMT)的分子机制.方法 将肾小管上皮细胞HK-2分为对照组(NC 组)、高糖组(HG 组)、pcDNA-LINC00052+HG 组、pcDNA-NC+HG 组、anti-miR-148b-3p+HG 组、anti-miR-NC+HG 组、miR-148b-3p+pcDNA-LINC00052+HG 组、miR-NC+pcDNA-LINC00052+HG组;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LINC00052和miR-148b-3p的表达水平;蛋白质印迹法(Western blot)检测E钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(vimentin)蛋白表达;CCK-8检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验分为:miR-NC+LINC00052-WT 组、miR-148b-3p+LINC00052-WT 组、miR-NC+LINC00052-MUT 组、miR-148b-3p+LINC00052-MUT 组;将 LINC00052 过表达载体、抑制表达载体及其阴性对照转染至HK-2细胞中,分为:pcDNA-NC组、pcDNA-LINC00052组、si-NC组、si-LINC00052组,检测LINC00052和miR-148b-3p的靶向关系.结果 与NC组比较,HG组的细胞活性、E-Cadherin 和 LINC00052 表达水平降低(均 P<0.001),miR-148b-3p、N-Cadherin 和 vimentin表达水平、细胞凋亡率升高(均P<0.001).与pcDNA-NC+HG组比较,pcDNA-LINC00052+HG组的miR-148b-3p、N-Cadherin和vimentin表达水平以及细胞凋亡率降低,E-Cadherin表达水平和细胞活性升高(均P<0.001).与 anti-miR-NC+HG 组比较,anti-miR-148b-3p+HG 组的 miR-148b-3p、N-Cadherin和vimentin表达水平以及细胞凋亡率降低,E-Cadherin表达水平和细胞活性升高(均P<0.001).与pcDNA-NC组比较,pcDNA-LINC00052组的LINC00052表达水平升高,miR-148b-3p表达水平降低(均P<0.001);与si-NC组比较,si-LINC00052组的LINC00052表达水平降低,miR-148b-3p 表达水平升高(均P<0.001).与 miR-NC+pcDNA-LINC00052+HG 组比较,miR-148b-3p+pcDNA-LINC00052+HG 组 miR-148b-3p、N-Cadherin 和 vimentin 表达水平以及细胞凋亡率升高,E-Cadherin表达水平以及细胞活性降低(均P<0.001).结论 LINC00052通过靶向miR-148b-3p抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡及EMT,促进细胞增殖.

基因捕获技术在肝癌侵袭和迁移相关基因筛选中的应用

目的:用基因捕获技术在肝癌细胞SMMC7721细胞中寻找与肝癌侵袭和迁移相关的基因。方法:首先,将p U21质粒转染到肝癌细胞SMMC7721细胞,用G418筛选出单克隆稳定细胞系;其次,采用Transwell小室实验和划痕实验,检测这些单克隆细胞侵袭和迁移能力的变化;最后,用5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测这些细胞系中被p U21质粒捕获的基因。结果:成功获得了约300株稳定转染p U21质粒的单克隆细胞系,得到了约30株侵袭和迁移能力增强的细胞株和约40株侵袭和迁移能力减弱的细胞株。通过5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测,证明了在A554细胞系中,被p U21质粒捕获的基因是long inter-genic non-protein coding RNA 52(LINC00052)。结论:应用基因捕获技术筛选肝癌侵袭和迁移相关基因是可行的。