基于UFLC-QTrap-MS/MS结合多元统计分析的不同产地、不同部位乌药中核苷和氨基酸类成分分析

本研究建立了一种超快速液相色谱-三重四极杆/线性离子阱-串联质谱(UFLC-QTrap-MS/MS)同时测定乌药中11种核苷类和14种氨基酸类成分的分析方法,并结合多元统计分析比较不同产地、不同部位乌药的质量。采用Waters XBridge Amide色谱柱(2.1 mm×100 mm×3.5μm),以0.2%甲酸水溶液(A)-0.2%甲酸乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱;在电喷雾正离子模式下,以多反应监测(MRM)进行质谱检测;基于各成分的质量浓度,用方差分析(ANOVA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)、层次聚类分析(HCA)、逼近理想解排序法(TOPSIS)以及灰色关联度分析(GRA),对不同产地、不同部位乌药样品进行综合评价。结果表明,所测成分在一定浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数均大于0.9924;精密度、重复性、稳定性良好,平均加样回收率为94.86%~106.47%,相对标准偏差(RSD)均小于4.55%。不同产地、不同部位乌药样品间存在一定的差异,HCA和PCA 2种方法均将样品分为3类。OPLS-DA模型分析通过VIP值共筛选得到6个差异性化合物,分别为尿苷、丙氨酸、胞嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤。该方法简便、灵敏度高、重现性好,可用于乌药中核苷和氨基酸类成分的同时测定,为药材质量评价和综合利用提供方法参考。

天台乌药的组织培养与快速繁殖

以药用植物天台乌药当年生嫩茎为外植体,新芽萌动后取材,研究不同培养基对其组织培养和植株再生的影响。结果表明,最适的不定芽增殖培养基为MS+6-BA 2.0～3.5 mg.L-1+NAA 0.2 mg.L-1+Na2S2O31.25%(蔗糖3%),最佳的生根培养基为1/4 MS+IBA 1.0 mg.L-1(不加肌醇,蔗糖2%)。

基于GC-MS和UPLC-ESI-MS/MS法研究乌药化学成分

目的：研究湖南产乌药化学成分。方法：分别采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用法和液相色谱-质谱（UPLC-ESI-MS/MS）对乌药中挥发油和甲醇提取物的化学成分进行分析。在GC-MS中,以HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25μm）为色谱柱,采用程序升温法,EI离子源,扫描质量范围为m/z 35～400 amu;在UPLC-ESI-MS/MS中,以Acquity UPLC BH C18（50 mm×2.1 mm,1.7μm）为色谱柱,采用0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,ESI源,扫描质量范围为m/z 100～1 200。结果：利用GC-MS法共鉴定了乌药中68个挥发性成分,主要为单萜类物质。利用UPLC-ESI-MS/MS法在甲醇提取物中共鉴定出42个化合物,其中24个呋喃倍半萜及其内酯、10个生物碱、6个黄烷醇多酚及其缩合物、1个有机酸和1个甾醇类化合物。结论：系统研究了湖南产乌药中的化学成分,为湖南产乌药的药效物质基础及质量控制研究提供一定的理论依据。

乌药叶黄酮类化学成分研究

目的:研究樟科山胡椒属植物乌药叶的化学成分。方法:利用硅胶柱和ODS反相柱色谱分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据(1H-NMR1,3C-NMR)鉴定结构。结果:从乌药叶中分离得到8个黄酮类化合物,分别为:槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷(1)、山奈酚-3-O-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚(3)、二氢山奈酚-3-O-L-鼠李糖苷(4)、槲皮素(5)、槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷(6)、槲皮素-3-O-α-D-吡喃葡萄糖苷(7)、山奈酚-3-O-D-吡喃葡萄糖苷(8)。结论:化合物2、4和8均为首次从该植物中分离得到。

乌药叶总黄酮的抗氧化作用及对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用

目的考察乌药叶总黄酮(LA-flavonoids)的抗氧化作用,初步探讨其抗氧化机制。方法在化学模拟体系中,利用总抗氧化能力和抗超氧阴离子自由基试剂盒评价LA-flavonoids抗氧化活性。利用腹腔注射四氯化碳(CCl4)造成小鼠急性肝损伤动物模型,以血清转氨酶活性以及总抗氧化能力、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平为指标判断LA-flavonoids对化学性肝损伤的保护作用,并通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法测定肝组织中相关抗氧化基因表达量的变化。结果在化学模拟体系中,随着LA-flavonoids浓度的增加,其总抗氧化活性和抗超氧阴离子自由基活性均显著增加。在CCl4肝损伤模型中,50～200mg/kg的LA-flavonoids均可显著降低肝损伤小鼠血清转氨酶的活性,显著增强总抗氧化能力和SOD活力,减少MDA释放;进一步研究发现,LA-flavonoids可显著提高受损肝组织中抗氧化相关基因thioredoxin(抗细菌硫氧还原蛋白)、hemeoxygenase-1(血红素加氧酶-1)以及peroxiredoxin-1(过氧化物酶-1)的表达。结论LA-flavonoids能通过清除自由基,抑制脂质过氧化产生,从而保护CCl4所致小鼠急性肝损伤,其机制可能与调节抗氧化相关基因的表达有关。

乌药的毒性研究

目的 了解乌药经口毒性及致突变情况。方法 毒理学常规方法。结果 乌药经口LD50 >10 0g/kg体重 ;小鼠微核试验阴性 ;小鼠精子畸形试验阴性 ;Ames试验阴性 ;3 0d喂养试验高剂量组大鼠肝脏相对增大 ,雌、雄分别与对照组相比P <0 .0 5和P <0 .0 1,大鼠生长发育、血生化及病理组织学观察等指标无明显影响。结论 乌药属实际无毒 ,无致突变性。

大孔吸附树脂纯化乌药叶黄酮化合物研究

通过比较XDA-1,HPD-300,HPD-600,X-5,NKAII,D101,AB-8,HP-20等8种大孔吸附树脂对乌药叶中黄酮类化合物的吸附及解吸性能的影响,筛选出效果较好的HP-20树脂进行了分离纯化实验研究.实验表明,HP-20树脂能够有效地吸附和解吸乌药叶中黄酮类化合物,并确定了其最佳的吸附和解吸工艺参数.采用最佳的工艺条件分离纯化乌药叶中黄酮类化合物,其含量由18%提高到71%,为进一步开展乌药叶中黄酮类化合物纯化工艺的研究打下了基础.

氢化物发生原子荧光法测定银鱼中的砷、汞、硒、镉

采用微波消解法处理银鱼(Lindera aggregate(Sims)Kosterm)样品,然后用氢化物发生-原子荧光法测定样品中的砷、汞、硒和镉的含量。结果表明,该方法的加标回收率为95.8%～104.6%,相对标准偏差均小于4%,具有良好的精密度和准确度。4种元素的检出限为0.04～0.13 ng/mL,能满足水产品中金属元素的测定要求。银鱼中砷、汞、硒和镉的含量均未超出限量值。该方法简便、快速、灵敏,在实际样品的测定中得到了满意的结果。

乌药叶化学成分的研究

目的研究乌药Lindera aggregate(Sims) Kosterm叶的化学成分。方法乌药叶70%乙醇提取物采用硅胶、Sephadex LH-20、制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到13个化合物,分别鉴定为hydroxylinderstrenolide(1)、lindenanolide H(2)、lindenanolide A(3)、atractylenolideⅢ(4)、chlojaponilactone A(5)、9,9′-dihydroxy-3,4-methylenedioxy-3′-methoxy[7-O-4′,8-5′] lignans(6)、槲皮素(7)、山柰酚(8)、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷(9)、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(10)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(11)、山柰酚-3-O-(4″-反式-对-香豆酰基)-α-L-鼠李糖苷(12)、山柰酚-3-O-(2″,4″-二-反式-对-香豆酰基)-α-L-鼠李糖苷(13)。结论其中化合物2~6、12~13为首次从该植物中分离得到。

高效液相色谱法测定乌药叶中槲皮苷的含量

目的建立高效液相色谱测定乌药叶中槲皮苷含量的方法。方法色谱柱为Shimpack VP-ODS色谱柱,流动相为乙腈-0.5%冰醋酸(20∶80),检测波长254nm,柱温40℃,流速1mL·min-1。结果槲皮苷在1～100μg·mL-1(r=0.9999)范围内呈现良好的线性关系;槲皮苷回收率为98.38%,RSD为1.85%;样品溶液在24h内稳定。结论该方法测定准确、快速简单,线性关系良好。

磁场对乌药试管苗生长的生物学效应研究

[目的]为磁处理在乌药规模化育苗中的应用提供理论依据。[方法]以乌药试管苗为对象,在6、12、17、27 mT 4个磁感应强度(一组)分别与5、10、15 h 3个处理时间的组合条件下,研究磁场对乌药试管苗生长的生物学影响,筛选最佳的磁处理条件。[结果]不同磁处理条件对乌药试管苗生长的生物学效应不同。27 mT/15 h对苗高,17 mT/15 h与27 mT/15 h对不定芽,12 mT/15 h、17 mT/15 h与27 mT/15 h对乌药试管苗重量均具有抑制作用;其他磁处理条件对乌药试管苗的苗高、不定芽、重量等均有不同程度的促进作用。[结论]4个磁感应强度(6、12、17、27 mT)与10 h的组合对乌药试管苗生长(苗高、不定芽、苗重)都具有正生物学效应。17 mT/10 h对苗高、6 mT/10 h与6 mT/15 h对不定芽、6 mT/10 h对乌药试管苗重量均具有明显的正生物学效应。

原子吸收光谱法对赣南产乌药中六种金属元素的测定

运用火焰原子吸收光谱法测定赣南产乌药中Fe、Cu、Mg、Ca、Mn、Zn6种金属元素。用浓硝酸微波消解样品,采用标准曲线法测定。所测定的乌药含有丰富的人体必需金属元素,采用此方法回收率在90.00%～101.33%之间。该方法简单、准确,结果令人满意。

氢化物发生-原子荧光法测定乌药中的砷、汞、硒、镉

采用微波消解法处理样品,然后用氢化物发生-原子荧光法测定乌药[Lindera aggregate(Sims)Kosterm]中的砷、汞、硒和镉含量。结果表明,加标回收率为96.8%～103.9%,相对标准偏差均小于4%,具有良好的精密度和准确度。各元素的检出限为0.05～0.36 ng/mL,能满足中草药中无机元素的测试要求。乌药中的砷、汞、硒和镉含量均未超出限量范围。该方法简便、快速、灵敏,对于实际样品的测定得到了满意的结果,便于推广应用。

乌药总生物碱抗炎镇痛效果研究

用索氏法氨水-氯仿提取得到乌药[Lindera aggregata(Sims)Kosterm]总生物碱,采用p-二甲苯致小鼠耳廓肿胀法和角叉菜胶致后足跖肿胀法、小鼠热板法和乙酸致小鼠扭体法等方法来评估乌药总生物碱的抗炎镇痛效果。结果表明,乌药总生物碱有缓解p-二甲苯致小鼠耳廓肿胀及角叉菜胶致后足跖肿胀的效果,能显著减少小鼠在热板上舔后足的次数和减少乙酸致小鼠扭体的次数,镇痛效果显著。

HPLC测定乌药叶中槲皮素的含量

目的:建立高效液相色谱测定乌药叶中槲皮素含量的方法。方法:色谱柱(ZORBAX ECLIPSE XDB-C18,150 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇∶0.4%磷酸=50∶50为流动相,流速:1.0 mL/min,检测波长:360 nm,柱温:30℃。结果:槲皮素在0.129μg～1.29μg内线性关系良好(r2>0.9999);重复性RSD为4.2%;平均加样回收率为101.0%,RSD为2.37%。结论:该方法专属性强,简便快捷,结果准确,可用作乌药叶槲皮素的含量测定。

乌药对大鼠急性酒精性肝损伤保护作用的实验研究

目的观察乌药对大鼠急性酒精性肝损伤模型肝功能及肝组织的影响。方法将大鼠随机分为5组，正常对照组、模型对照组、阳性对照组、乌药1g·kg-1组、乌药2g·kg-1组。除正常组外，其余各组大鼠均按10mL·kg-1体重灌胃给予经稀释的56度二锅头，每日2次，连续12d，复制大鼠急性酒精性肝损伤模型，治疗组在造模同时给予乌药水提物保护。测定血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT），并进行肝脏的病理组织学观察。结果乌药高、低剂量组血清中AST、ALT水平降低，肝组织脂肪变性、坏死、炎症细胞浸润程度减轻。结论乌药水提物对大鼠急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。

乌药水提取物抗心律失常作用的研究

目的研究乌药水提取物的抗心律失常作用。方法采用常规抗心律失常方法,将三氯甲烷诱发小鼠室颤试验和氯化钙诱发大鼠室颤试验分为生理盐水组、维拉帕米组、10.0 mg/kg乌药水提取物组和30.0 mg/kg乌药水提取物组;将肾上腺素诱发家兔心律失常试验分为给药前后组;蟾蜍离体坐骨神经动作电位试验分为任氏液组、1.0%盐酸普鲁卡因溶液组、0.5 g/ml和1.0 g/ml乌药水提取物组。结果乌药水提取物对三氯甲烷诱发的小鼠室颤具有明显的治疗作用(P<0.05),对氯化钙诱发的大鼠室颤具有明显的预防效果(P<0.05),能明显对抗肾上腺素诱发的家兔心律失常(P<0.01),可明显降低蟾蜍离体坐骨神经动作电位振幅(P<0.05)。结论乌药水提取物具有明显的抗试验性心律失常作用,能对抗由三氯甲烷、氯化钙、肾上腺素等诱发的心律失常,其抗心律失常作用可能与其抑制Na+内流及与阻断β-肾上腺素受体有关。

超声波辅助萃取法提取乌药叶黄酮类化合物的工艺研究

以乌药叶为原料,用均匀设计试验法优化了乌药叶总黄酮(FL)的超声波提取工艺,考察了乙醇体积分数、液固比、超声波功率和超声波作用时间4个因素对乌药叶总黄酮提取率的影响,确立了乌药叶总黄酮的优化超声波提取工艺条件为:5 g乌药叶粉,超声波作用时间18 min,超声波功率250 W,乙醇体积分数40%,液固比10∶1(mL∶g),测得乌药叶总黄酮得率为2.13%。对超声波提取进行了数学模拟,模拟值与试验结果吻合良好。

乌药对急性酒精性肝损伤模型大鼠炎性因子的影响

目的初步观察乌药对急性酒精性肝损伤模型大鼠炎性因子的影响。方法采用梯度灌胃法建立急性酒精性肝损伤大鼠模型,造模的同时灌胃给予乌药不同提取部位连续10 d。末次给药后取血,测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)含量;处死后解剖取肝脏,采用免疫组织化学法检测肝组织中NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达情况。结果乌药能有效降低模型大鼠血清ALT、AST含量;能不同程度地抑制肝细胞中IL-1β、NF-κB、TNF-α的表达。结论乌药对急性酒精性肝损伤具有良好的保护作用,该作用与其抑制IL-1β、NF-κB、TNF-α表达,减轻炎症反应有关。

乌药的离体培养和植株再生研究

[目的]为乌药的规模化人工育苗提供理论依据。[方法]以乌药植物当年生健壮枝条为外植体,研究不同激素种类及浓度对其不定芽的诱导及生根的影响,筛选出最佳培养基。[结果]适宜于乌药组织培养的最佳外植体取材时间为6～7月,以当年生带芽茎段的嫩枝为最适宜;2.5 mg/L 6-BA是乌药不定芽增殖时最有效的浓度;诱导乌药外植体不定芽增殖的最佳培养基为MS＋6-BA 2.5mg/L＋NAA 0.2 mg/L;乌药苗在增殖过程中的继代周期以40～50 d为宜;最佳壮苗培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L;最佳生根培养基为MS＋NAA 0.5 mg/L,生根率98%～100%。[结论]采用合适的外植体以及激素种类与浓度为最佳配比的培养基可使传统的中药材乌药植物成功地诱导不定芽的分化、生根与再生。