Chemical characters and protective effect of Baqi Lingmao formula(巴芪灵猫方) on experimental liver injury

OBJECTIVE:To investigate the chemical characters of water-extract of Baqi Lingmao formula(巴芪灵猫方,BQLM formula)and its effects on anti-liver injury in model mice and live cells.METHODS:BQLM formula was composed of ten herbal medicines.We determined the contents of alkaloids,saponins,phenolic acids and flavonoid in BQLM formula by UV spectrophotometry.The active components of alkaloids and phenolic acids in BQLM formula were identified by HPLC chromatography.The anti-hepatic injury effects of BQLM formula were investigated with concanavalin A(Con A)-induced hepatitis model of mice,human liver LO2 and Hep G2.2.15 cells.RESULTS:BQLM formula(2 and 10 g/kg,orally)significantly improved the damages of liver tissues and functions caused by Con A in mice,reduced the infiltration of inflammatory cells into liver and inhibited the inflammatory cytokine secretion of interferon-γ,tumor necrosis factor-αand interleukin-6.BQLM formula simultaneously decreased the levels of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase of liver and serum,and recovered the superoxide dismutase and catalase activities of liver to normal levels in Con A-induced hepatic-injury mice.The serum of BQLM formula group stimulated the human liver LO2 cell proliferation in vitro.Further,BQLM formula obviously promoted the proliferation of normal hepatocytes(LO2 cells)and inhibited the hepatocytes death induced by Con A.It also significantly inhibited the proliferation of Hep G2.2.15 cells and decreased the secretion of HBs Ag and HBe Ag in vitro.CONCLUSIONS:BQLM formula has anti-inflammation and anti-hepatitis virus Beffects,and is capable of improving liver injury in vivo and in vitro.

灵猫方调控HBV相关免疫应答的机制研究

目的:通过蛋白质组学技术及组织病理学观察并验证灵猫方调控HBV相关免疫应答的作用及机制。方法:将30只SPF级雄性C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、灵猫方组,每组10只。除正常组外,其余小鼠采用水动力转染技术建立HBV体内复制模型,灵猫方组小鼠给予灵猫方灌胃,2次/d,模型组和正常组小鼠给予等体积饮用水,连续灌胃3 d。Elisa检测分析小鼠血清HBsAg、HBeAg、IFNα含量,IHC染色观察小鼠肝组织F4/80表达,实时荧光定量PCR检测小鼠肝组织TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子的含量,高通量蛋白质组学技术检测小鼠肝脏免疫细胞蛋白质表达,筛选差异表达的信号通路。结果:与模型组比较,灵猫方组小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度明显下降(P<0.05,P<0.01),IFNα水平显著上升(P<0.0001),肝组织F4/80蛋白表达量明显降低(P<0.01)。GO分析显示,灵猫方组小鼠差异蛋白显著富集于代谢相关功能;KEGG分析显示,差异蛋白显著富集于PPAR通路;差异蛋白表达定量分析显示,与模型组相较,灵猫方组小鼠免疫细胞的代谢能力下降,天然免疫应答上升。结论:灵猫方可能通过作用于PPAR信号通路,参与免疫细胞脂质代谢重编程,进而增强HBV相关免疫应答,同时抑制促炎因子的释放。

灵猫方药物血清体外抗乙肝病毒作用的研究

目的:观察灵猫方药物血清对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制效果。方法:应用SD大鼠备置5倍和10倍灵猫方药物血清、生理盐水大鼠血清,将3种血清分别作用于HepG2.2.15细胞,在第72小时、96小时、144小时收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测HBsAg、HBeAg。结果:与生理盐水大鼠血清相比较,灵猫方药物血清在72小时后即产生抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,96小时时对乙肝病毒(HBV)的抑制率达到高峰,在144小时对HBV的抑制率有所下降;5倍灵猫方药物血清和10倍灵猫方药物血清在抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg方面,差异无显著性意义。结论:灵猫方药物血清在体外具有一定的抗HBV的作用。

灵猫方通过增强天然免疫功能抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的:研究灵猫方对pHBV1.3转染Hep G2细胞的天然免疫功能的影响,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制。方法:制备0.25mg/ml和0.5mg/ml灵猫方水提物干预HBV质粒转染HepG2细胞,以0.9%Na Cl溶液作为空白对照组,72h后收集培养上清液,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-λ1及干扰素效应蛋白OAS1、Mx A、PRKmRNA表达水平,RIG-I mRNA表达水平。结果:与空白对照组比较,0.5mg/ml灵猫方干预pHBV1.3转染Hep G2细胞分泌的HBsAg和HBeAg水平明显降低,细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-λ1 mRNA及OAS1、Mx A、PRKmRNA表达水平表明显升高(P<0.01),RIG-I mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。结论:灵猫方通过促进pHBV1.3质粒转染HepG2细胞的I、III型干扰素产生,增强天然免疫功能,从而抑制HBV复制,可能是通过RIG-I通路诱导干扰素产生,增加干扰素的形成。

灵猫方抑制饥饿诱导HepG2.2.15细胞自噬研究

目的研究灵猫方对饥饿诱导HepG2.2.15细胞自噬的作用。方法选取15只SD大鼠制备灵猫方药物血清,设立厄尔平衡盐缓冲液(Earle's balanced salt solution,EBSS)组、EBSS+空白血清组、EBSS+5倍药物血清组、EBSS+10倍药物血清组及DMEM组,每组3个样本。培养HepG2.2.15细胞1、2、4及6h,构建pEGFP-N1-LC3B表达载体,转染HepG2.2.15细胞,在荧光显微镜下观察细胞浆中GFP-LC3B分布表达变化,计算点状样GFP-LC3B的细胞数与GFP-LC3B转染HepG2.2.15细胞数比值。透射电镜观察各组HepG2.2.15细胞浆内自噬体。Western Blot检测各组HepG2.2.15细胞LC3BⅡ/Ⅰ比值(microtubule-associ-ated protein 1 light chain 3 betaⅡ/Ⅰ)。结果培养2h时,与EBSS+空白血清组比较,EBSS+5倍药物血清、EBSS+10倍药物血清明显抑制GFP-LC3B由散在分布向点状分布改变(P<0.01),电子透射电镜显示EBSS+5倍药物血清组、EBSS+10倍药物血清组抑制自噬体形成,Western Blot检测显示EBSS+10倍药物血清组LC3BⅡ/Ⅰ比值较EBSS+空白血清组明显下降(P<0.01)。结论灵猫方药物血清抑制饥饿诱导HepG2.2.15的自噬。

灵猫方及其单味药醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原表达的影响

目的研究灵猫方及其单味药(牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿、猫爪草、生黄芪)醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达的影响。方法制备灵猫方及其7种单味药的醇提物,分别配制成50、100、200、400μg/mL4个浓度,作用于HepG2.2.15细胞72h,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测药物的细胞毒性;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg水平。结果灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用,且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。牡丹皮醇提物、青皮醇提物、胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用,且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。猫人参醇提物、淫羊藿醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用,且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。结论灵猫方醇提取物及组分的牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿醇提取物能抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达。

灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞La蛋白表达的影响

目的研究灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞cccDNA、pgRNA、sRNA和La-mRNA抑制作用,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制。方法制备灵猫方水提物,500 mg/L和1 000 mg/L灵猫方水提物分别干预HepG2.2.15和HepAD38细胞,以0.9%Na Cl溶液作为空白对照组,6 d后收集培养液上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和LamRNA表达水平。结果与空白对照组比较,灵猫方组的HepG2.2.15和HepAD38细胞的HBsAg和HBeAg分泌水平明显降低,细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和LamRNA表达水平明显降低(P<0.01)。结论灵猫方可能通过抑制HepG2.2.15和HepAD38细胞内La蛋白的表达而促进pgRNA、sRNA和cccDNA的降解,从而抑制HBV的复制。

基于网络药理学和动物实验研究灵猫方治疗慢性乙型肝炎的机制

目的探讨灵猫方治疗慢性乙型肝炎与Ⅰ型IFN的相关性。方法TCMSP数据库筛选灵猫方主要活性成分;Genecards数据库获取灵猫方、慢性乙型肝炎作用靶点;Bioinformatics获取药物与疾病靶点交集、绘制韦恩图、并进行GO富集分析;DAVID 6.8进行KEGG富集分析;CytoScape 3.8.0进行免疫过程分析。30只SPF级雄性C57BL/6N小鼠,随机分为正常组、模型组、灵猫方组,每组10只,除正常组10只外,余20只采用水动力转染技术建立HBV体内复制模型,灵猫方灌胃3 d,2次/d,模型组、正常组同体积生理盐水灌胃。结束后收集血清样本,ELISA检测HBsAg、HBeAg、Ⅰ型IFN水平变化。计量资料两组间比较采用独立样本t检验,组间多重比较采用One-way ANOVA结合最小显著性差异法LSD进行多重比较分析。结果网络药理学获取灵猫方22个活性成分、6059个作用靶点,481个慢性乙型肝炎相关靶点,387个药物-疾病交集靶点,并提出灵猫方通过调控Ⅰ型IFN参与乙型肝炎相关免疫应答的假设。动物实验证实与模型组比较,灵猫方组HBsAg(t=2.227,P=0.043)、HBeAg(t=2.488,P=0.026)显著下降,且HBsAg(t=-4.603,P<0.001)、HBeAg(t=-2.224,P=0.043)下降幅度亦具有统计学差异;与正常组相比,模型组IFNα、IFNβ水平无明显变化(P值均>0.05),灵猫方组IFNα、IFNβ水平显著上升(P值均<0.001);与模型组相比,灵猫方组IFNα、IFNβ水平亦显著上升(P值均<0.001)。结论灵猫方通过调控Ⅰ型IFN的分泌,达到抗HBV的作用。

羚茅汤治疗急性出血性脑中风75例临床分析

目的:探讨羚茅汤治疗急性出血性脑中风的临床效果。方法:回顾性分析我院75例急性出血性脑中风患者临床资料,所有患者均应用羚茅汤进行治疗。结果:治疗后,患者意识水平量分明显高于治疗前,P<0.05;患者血肿体积显著小于治疗前,P<0.05。结论:羚茅汤治疗急性出血性脑中风,临床效果显著,能够减少血肿体积,具有安全性和可靠性,值得临床推广。

灵猫方联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者的疗效及对NK细胞功能的影响

目的:观察灵猫方联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床疗效及其对患者外周血自然杀伤细胞(NK)数量、功能的影响,探讨灵猫方治疗CHB的免疫调节机制。方法:纳入54例符合标准的CHB患者,随机分为单用组27例和联合组27例,同时纳入10例健康志愿者作为健康对照组。两组均给予口服替比夫定治疗,联合组加服灵猫方,疗程为24周。治疗3个月、6个月时,评价两组患者的中医证候积分,检测两组患者的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、HBV-DNA定量、HbeAg、外周血NK细胞数量及细胞表面和胞内Toll样受体(TLRs)的表达水平,比较两组患者的ALT、AST复常率,HBV-DNA阴转率和HBeAg血清转换率。结果:治疗3个月、6个月后,两组患者的中医证候积分较治疗前均显著降低(P<0.05,P<0.01),且联合组患者的中医证候积分明显低于单用组(P<0.01)。治疗3个月、6个月后,两组患者的ALT、AST水平均显著降低(P<0.01),且治疗3个月时,联合组患者的ALT、AST水平低于单用组(P<0.05),ALT、AST复常率明显高于单用组(P<0.05)。治疗3个月、6个月后,两组患者的HBVDNA、HBeAg水平均明显降低(P<0.01),但两组患者的HBV-DNA转阴率、HBeAg血清转换率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与健康对照组比较,CHB患者的外周血NK细胞数量明显减少(P<0.05),NK细胞胞内TLR3、TLR9表达水平显著降低(P<0.05);治疗3个月、6个月后,两组患者的NK细胞数量及胞内、胞外TLR3、TLR9表达水平较治疗前均明显提高(P<0.05),且联合组患者NK细胞数量及其胞内TLR3表达水平明显高于单用组(P<0.05)。结论:灵猫方联合替比夫定可显著改善CHB患者的中医证候和肝功能,灵猫方的作用机制可能与提高患者的NK细胞数量及其胞内外TLR3的表达水平,从而调节机体的免疫功能有关。

灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎临床研究

目的:探讨灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎(1×ULN≤ALT≤2×ULN)的临床疗效。方法:采用随机、双盲、安慰剂对照的方法,将56例患者分为治疗组28例和对照组28例。治疗组给予灵猫方联合恩替卡韦治疗,对照组给予安慰剂联合恩替卡韦治疗,疗程为12个月。观察两组患者的临床疗效及血清HBV-DNA、HBeAg、HBsAg水平的变化。结果:治疗后,治疗组和对照组的总有效率分别为92.86%和89.29%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗组患者的HBV-DNA、HBsAg、HBeAg下降幅度明显大于对照组(P<0.05)。结论:灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎(1×ULN≤ALT≤2×ULN),在抑制乙肝病毒复制,降低HBsAg、HBeAg的表达方面优于单用恩替卡韦。

中药灵猫方的抗肝纤维化作用及其机制

目的研究灵猫方抗肝纤维化的作用及其机制。方法 55只BALB/c小鼠随机分为4组:正常组、模型组、秋水仙碱组、灵猫方组。ConA(15mg/kg)尾静脉注射制作肝纤维化模型,每周两次,共10周。正常组给予双蒸水灌胃,其余组分别给予秋水仙碱(0.2mg/kg)、灵猫方(7.5g/kg)。末次灌胃24h后处死小鼠,检测肝脏病理变化以及血清ALT、AST、ALB、DBIL表达水平、肝组织羟脯氨酸(HYP)含量变化、肝组织纤维化蛋白(FBRS)的表达水平。结果 (1)与模型组相比,灵猫方组血清ALB水平明显增加,DBIL水平明显降低(P均<0.01),HYP的含量明显降低(P<0.05)。(2)肝脏病理学检测,灵猫方组肝纤维化的程度和胶原显色指数较模型组明显减轻(P<0.05,P<0.01)。(3)与正常组相比,模型组的FBRS表达水平明显增加(P<0.05),与模型组相比,灵猫方组肝组织中FBRS的表达水平明显降低(P<0.05)。结论中药灵猫方通过降低肝组织纤维化蛋白的表达发挥抗肝纤维化的作用。

巴芪灵猫方及单味药材水煎浸膏的特征薄层色谱研究

目的 研究巴芪灵猫方全方及10个单味药材水煎浸膏的薄层特征图谱,用于药材和制剂的鉴别和质量控制。方法 采用优化后水煎提取工艺分别对3批全方、制巴戟天、炙淫羊藿、生地黄、黄芪、炒白术、猫爪草、灵芝、苦参、丹参和醋青皮药材及其对照药材进行提取,制备其水煎浸膏。采用HF_(254)高效薄层层析硅胶板,选用不同的展开剂分别对全方或单味药材水煎浸膏进行薄层色谱制备。经稀硫酸显色后,采用日光和紫外线(254 nm和365 nm)进行检视。结果 薄层色谱斑点清晰,分离度和重复性良好,具有良好的特征性。结论 可作为巴芪灵猫方全方及单味药材水煎浸膏的质量控制方法之一。