机体脱水对Lipocalin-2蛋白质表达的影响

[目的]研究在机体脱水时,视上核中Lipocalin-2蛋白质表达的变化。从蛋白组学的水平上阐述大细胞神经元在调节机体水盐平衡过程中的作用。[方法]采用动物实验,实验组正常饮食但剥夺饮水72h后,断头法处死动物,取视上核组织,用免疫印迹法检测Lipocalin-2蛋白。[结果]慢性脱水刺激后,实验组Lipocalin-2蛋白的表达上调,显著高于对照组(P﹤0.05)。[结论]Lipocalin-2蛋白在调节血浆水盐代谢平衡和心血管功能方面有着重要作用。

C反应蛋白/白蛋白比值对2型糖尿病合并急性心肌梗死患者远期不良心脑血管事件的预测价值研究

背景急性心肌梗死(AMI)是威胁全球公众健康的主要原因之一。虽然已有相应的再灌注治疗策略,但AMI相关的主要不良心脑血管事件(MACCEs)仍然是全世界人口死亡的原因之一。尤其合并糖尿病的AMI患者,因冠状动脉病变复杂,病变程度严重,尽早发现和判断该部分患者远期预后相对困难,因此寻找相对简便、易获得的实验室指标,有利于为2型糖尿病(T2DM)合并AMI患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后MACCEs的预测提供依据。目的探讨血清C反应蛋白(CRP)/白蛋白(Alb)比值(CAR)对T2DM合并AMI患者PCI术后远期MACCEs的预测价值。方法纳入2014—2019年就诊于宁夏医科大学总医院心血管内科1683例T2DM合并AMI患者为研究对象,收集患者的一般临床资料与检查结果。对所有患者进行电话或门诊随访,以全因死亡、非致死性心肌梗死、再发不稳定型心绞痛、非致死性脑卒中、新发心力衰竭或心力衰竭加重再入院、再次血运重建作为MACCEs。根据患者随访期间是否发生MACCEs分为MACCEs组(508例)和非MACCEs组(1175例)。采用单因素及多因素Logistic回归分析探讨T2DM合并AMI患者MACCEs事件的影响因素。采用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,生存曲线的比较采用Log-rank检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析CAR对T2DM合并AMI患者远期发生MACCEs的预测效能,使用净重分类改善指标(NRI)和综合判别指数(IDI)评价CAR对T2DM合并AMI患者预后评估的改善效果。结果1683例患者中508例(30.18%)患者发生MACCEs。多因素Logistic回归分析显示高血压病[OR(95%CI)=1.994(1.142~3.483)]、冠状动脉植入支架长度[OR(95%CI)=1.031(1.002~1.062)]、CRP[OR(95%CI)=0.950(0.915~0.986)]、Alb[OR(95%CI)=0.933(0.880~0.989)]及CAR[OR(95%CI)=5.582(1.705~18.277)]是T2DM合并AMI患者PCI术后发生MACCEs的影响因素(P<0.05)。根据CAR中位表达水平(0.86),将患者分为CAR<0.86组和CAR≥0.86组,Log-rank检验结果显示,CAR≥0.86组MACCEs发生率高于CAR<0.86组(52.68%与22.92%;χ^(2)=65.65,P<0.001)。ROC曲线显示CAR预测T2DM合并AMI患者发生MACCEs的ROC曲线下面积为0.728(95%CI=0.702~0.754),最佳截断值为0.576,灵敏度为0.617,特异度为0.747。在基线模型基础上,与CRP、Alb相比,CAR能明显改善对患者发生MACCEs的预测效果(NRI=0.377,IDI=0.166,C指数=0.690;P<0.05)。结论CAR是T2DM合并AMI患者PCI术后远期MACCEs发生风险的有效预测指标。

响应面法优化信号分子AI-2合成蛋白LuxS表达条件

群体感应是一种由自诱导物(autoinducers,AIs)介导的、细菌密度依赖的基因表达调控方式,已经被证实参与细菌多种生理功能的调控.信号分子AI-2介导的LuxS/AI-2型群体感应系统广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌,并备受关注.AI-2的合成依赖于S-核糖同型半胱氨酸酶(LuxS)的催化作用,而LuxS蛋白则是由luxS基因经过转录、翻译得到的.为了探索LuxS蛋白在表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中的最佳表达条件,从而获得较高产量且具有一定的生物活性的LuxS蛋白.首先对LuxS蛋白结构进行预测,确定E.coli BL21(DE3)作为表达菌株.其次,在单因素优化的基础上,进一步通过响应面法优化LuxS蛋白的表达条件.在菌液浓度OD 600为0.5、诱导温度为37℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导时间为31 h条件下,获得LuxS蛋白的最高表达量.研究成功优化了LuxS蛋白在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达条件,获得了具有生物活性的LuxS蛋白,并在后续的研究中成功合成了具有生物活性的信号分子AI-2,为体外合成AI-2奠定了基础.

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响:生物信息学分析和实验验证

背景:血管新生是心血管疾病的主要干预靶点,骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。目的:探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。方法:(1)生物信息学分析:通过Panglao DB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。(2)体内实验验证:建立小鼠后肢缺血模型,对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7,14和21 d血流灌注情况,免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。(3)体外实验验证:体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组,培养24 h,观察各组内皮细胞血管新生情况。结果与结论:(1)内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群,在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高,血管新生通路明显激活。(2)缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P<0.05),缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P<0.001)。(3)体外培养人脐静脉内皮细胞,缺氧干预后,内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加,血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高,Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P<0.001),并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P<0.01)。(4)结果证实,内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。

三结构域蛋白21对非酒精性脂肪性肝病的影响及机制研究

目的探讨三结构域蛋白21(tripartite motif containing protein 21,TRIM21)对游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)诱导的肝细胞脂质沉积的影响,并探讨核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)及相关基因在该过程中的作用。方法用TRIM21敲低慢病毒及TRIM21过表达质粒分别感染及转染细胞,构建TRIM21基因干扰体外模型并使用qRT-PCR和Western blotting实验进行模型验证;验证FFA诱导非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)体外模型方法的可行性;干扰TRIM21表达后建立NAFLD体外模型,油红O染色检测细胞脂质沉积情况;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧水平;qRT-PCR检测Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA表达水平;Western blottingting检测Nrf2、Keap1蛋白表达水平;免疫荧光检测Nrf2蛋白在细胞内的分布情况。结果(1)油红O染色结果表明:敲低TRIM21表达减少FFA诱导的肝细胞内脂质沉积(P<0.05),过表达TRIM21增加FFA诱导的肝细胞内脂质沉积(P<0.05)。(2)细胞内ROS水平检测结果显示:敲低TRIM21表达,胞内ROS水平降低(P<0.05),TRIM21过表达时胞内ROS水平升高(P<0.05)。(3)qRT-PCR检测结果显示:敲低TRIM21表达,Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA表达增加(P<0.05),TRIM21过表达时,Nrf2 mRNA表达增加(P<0.01),Keap1、HO-1表达减少(P<0.05)。(4)Western blotting结果显示:敲低TRIM21表达,Nrf2蛋白表达减少(P<0.01),Keap1蛋白表达增加(P<0.001),TRIM21过表达时Nrf2蛋白表达增加(P<0.05),Keap1蛋白表达减少(P<0.0001)。(5)敲低TRIM21表达Nrf2免疫荧光染色平均荧光强度(细胞核/细胞质)较对照组增加(P<0.001),TRIM21过表达时Nrf2平均荧光强度较对照组减少(P<0.001)。结论干扰TRIM21表达可能通过调节Nrf2及相关蛋白来影响FFA诱导的细胞脂质沉积,进而影响NAFLD发生发展过程。

阿司匹林抵抗和脂蛋白相关磷脂酶A2与复发性缺血性脑卒中的相关性分析

目的探讨非心源性卒中患者阿司匹林抵抗和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)与缺血性脑卒中复发的相关性。方法选取2021-10—2022-10在永城市人民医院住院的发病7 d内的急性非心源性缺血性脑卒中患者72例,基于临床病史和神经影像学证据分为初发组(n=36)和复发组(n=36),入院后规律服用阿司匹林7 d。采用血栓弹力图测定阿司匹林抵抗,并测定血清Lp-PLA2水平。比较初发组和复发组阿司匹林抵抗、Lp-PLA2水平,分析阿司匹林抵抗、Lp-PLA2与缺血性脑卒中复发之间的相关性。采用多元Logistic回归分析筛选复发性卒中独立危险因素,ROC曲线下面积评价相关危险因素的预测价值。结果36.1%的复发性卒中患者存在阿司匹林抵抗,19.4%的初发患者存在阿司匹林抵抗,2组比较差异有统计学意义(P<0.001)。复发性卒中患者血清PLA2水平中位数160.0μg/L,初次发病患者为125.0μg/L,2组比较差异有统计学意义(P=0.008)。多元Logistic回归分析显示阿司匹林抵抗和高PLA2水平是复发性缺血性脑卒中的影响因素,阿司匹林抵抗患者卒中复发风险增加4.06倍(P=0.042),高于Lp-PLA2中位值患者的4.37倍(P=0.011)。阿司匹林抵抗和Lp-PLA2预测卒中复发的ROC曲线下面积分别为0.753(95%CI:0.641~0.873)和0.683(95%CI:0.559~0.807)。结论与初发卒中患者相比,复发性卒中患者阿司匹林抵抗的比率和血清Lp-PLA2水平均明显升高,可作为复发性卒中的预测因素。

黄萎病菌诱导下陆地棉酵母双杂交文库的构建及GhMAPKKK2互作蛋白的筛选

为了探究棉花响应黄萎病菌侵染的分子机制并筛选GhMAPKKK2的互作蛋白,以陆地棉XLZ35为材料,基于Gateway克隆技术构建了棉花黄萎病菌诱导的陆地棉酵母双杂交文库,其中初级文库和次级文库的库容分别为1.2×10^(7)和2.0×10^(7)CFU,插入片段重组率均为100%且平均长度大于1000 bp。次级文库质粒浓度为953 ng·μL^(-1),符合构建酵母文库的标准,可用于酵母双杂交筛选互作蛋白。构建了pGBKT7-GhMAPKKK2表达载体,并验证了该载体对酵母细胞无毒性且不存在自激活活性。以GhMAPKKK2为诱饵蛋白,利用酵母文库初步筛选,获得81个阳性互作蛋白,经测序对比选取6个候选蛋白,通过酵母双杂交及双分子荧光互补试验(BiFC)验证,明确了候选蛋白GhFLA与GhMAPKKK2存在互作关系。本研究结果为解析GhMAPKKK2调控棉花抗黄萎病反应分子机制及调控网络提供了重要参考。

过表达带电多泡体蛋白2B基因抑制肾透明细胞癌细胞的增殖

目的肾透明细胞癌中带电多泡体蛋白2B(CHMP2B)的表达水平与临床病理特征及预后的关系,探究CHMP2B在肾透明细胞癌发生发展中的潜在作用机制。方法从TCGA数据库下载并整理肾透明细胞癌的RNAseq数据并提取FPKM格式的数据,比较肿瘤样本与癌旁样本CHMP2B的表达差异,根据其表达中位值分为高、低表达组,分析CHMP2B表达水平与临床病理特征的相关性,采用Kaplan-Meier模型进行生存分析,COX风险回归模型用于临床预后因素分析;使用ESTIMATE算法分析CHMP2B与免疫和基质细胞浸润及肿瘤纯度的关系;使用Limma包对CHMP2B筛选共表达基因,并进一步行GSVA富集分析。使用ESTIMATE算法和Timer数据库分析CHMP2B表达与免疫浸润的相关性;使用cBioPortal数据库分析CHMP2B的基因突变对肾透明细胞癌免疫治疗的影响;从HPA数据库获取CHMP2B蛋白质在肾透明细胞癌组织和正常组织的免疫组化表达情况;通过收集健康与肾癌患者外周血标本评价CHMP2B作为临床标志物的可能。通过细胞实验验证CHMP2B对肾癌细胞增殖与迁移的影响。结果与癌旁组织相比较,CHMP2B在肾透明细胞癌组织中低表达,使其过表达会抑制肿瘤细胞增殖(P<0.01),其表达水平与年龄、性别、是否淋巴结转移以及分期等具有相关性(P<0.05)。生存分析结果显示CHMP2B低表达肾透明细胞癌患者生存预后更差(P<0.05),富集差异分析及共表达基因富集发现CHMP2B在肾透明细胞癌中主要涉及病毒出芽、坏死性凋亡、内吞作用等,并涉及免疫调节过程。结论CHMP2B在肾透明细胞癌组织中低表达,可有效影响肿瘤进展和肿瘤免疫过程,是一种有前途的预后分子标志物及治疗靶点。

耐力训练大鼠抗动脉粥样硬化线粒体自噬通路中抗增殖蛋白2的作用

背景:运动可降低血脂,减缓动脉粥样硬化发展。动脉粥样硬化起始于线粒体功能障碍,而抗增殖蛋白2蛋白受耐力训练调控,参与线粒体自噬。目的:验证耐力训练干预动脉粥样硬化中抗增殖蛋白2蛋白在线粒体自噬通路中的作用。方法:将40只Wistar大鼠随机分为对照组、运动组、动脉粥样硬化组和动脉粥样硬化运动组,每组10只,后2组大鼠高脂饮食(9周)联合维生素D注射(第1,3,6周)构建大鼠动脉粥样硬化模型,同时2个运动组大鼠进行跑台递增训练干预9周。干预结束后进行血脂和病理检测观察造模及干预效果;酶标法和Western blot检测线粒体膜电位和自噬相关蛋白表达;免疫荧光观察主动脉中线粒体自噬蛋白的共定位情况。结果与结论:(1)血脂和病理切片显示,与动脉粥样硬化组相比,动脉粥样硬化运动组大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇水平和主动脉脂质沉积面积显著降低(P<0.001)。(2)线粒体膜电位显示,动脉粥样硬化运动组大鼠主动脉线粒体膜电位的显著降低得到逆转(P<0.01)。(3)Western blot显示,与对照组相比,动脉粥样硬化组大鼠线粒体抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1和Parkin蛋白表达显著升高(P<0.05),PARL和PGAM5蛋白表达降低(P<0.05);与动脉粥样硬化组相比,动脉粥样硬化运动组大鼠线粒体PINK1和Parkin蛋白表达显著降低(P<0.05),抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、PARL和PGAM5蛋白表达显著升高(P<0.05)。(4)免疫荧光结果显示,动脉粥样硬化组较对照组LC3和PINK1与TOMM20共定位显著增加(P<0.05),动脉粥样硬化运动组较动脉粥样硬化组LC3与TOMM20共定位显著增加(P<0.05);动脉粥样硬化组较对照组LC3和PARL与抗增殖蛋白2共定位显著增加(P<0.01),动脉粥样硬化运动组较动脉粥样硬化组LC3与抗增殖蛋白2共定位显著增加(P<0.01),PARL蛋白与抗增殖蛋白2共定位显著降低(P<0.01)。(5)结果表明,耐力训练可诱导线粒体内膜自噬受体抗增殖蛋白2表达,促进抗增殖蛋白2与线粒体自噬接头蛋白的结合完成线粒体自噬,恢复线粒体功能,减缓动脉粥样硬化发生。

卵黄蛋白原2对地塞米松诱导肥胖的治疗作用

卵黄蛋白原2(VTG2)被证明可促进3T3-L1脂肪细胞棕色化进程,但其是否能通过促进体内脂肪组织棕色化以治疗肥胖的作用尚未见报道。本试验为探索VTG2对小鼠白色脂肪组织(WAT)棕色化的影响,设置腺相关病毒空载组(AAV9-NC1)和VTG2处理组(AAV9-VTG2),利用苏木精-伊红(H.E.)染色观察WAT脂肪细胞面积大小,免疫组织化学(IHC)染色法、实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹(WB)法检测WAT棕色化标志因子解偶联蛋白-1(UCP1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1-alpha(PGC1α)的表达;为进一步探究VTG2对地塞米松(DEX)诱导的肥胖小鼠中WAT棕色化的影响,设置腺相关病毒空载组(AAV9-NC2组)、DEX处理组(AAV9-NC+DEX组)和VTG2治疗组(AAV9-VTG2+DEX组),采用上述方法检测相同指标。结果显示,与AAV9-NC1组相比,AAV9-VTG2组小鼠腹股沟WAT脂肪细胞面积极显著减小(P<0.01),UCP1和PGC1α的mRNA相对表达量均极显著升高(P<0.001或P<0.01),蛋白相对表达量均显著上调(P<0.01或P<0.05);与AAV9-NC2组相比,AAV9-NC+DEX组小鼠腹股沟WAT脂肪细胞面积极显著增加(P<0.01),UCP1和PGC1α的mRNA相对表达量均极显著降低(P<0.001或P<0.01),蛋白相对表达量均极其显著下调(P<0.001);与AAV9-NC+DEX组相比,AAV9-VTG2+DEX组中小鼠腹股沟WAT脂肪细胞面积极其显著减小(P<0.001),UCP1和PGC1α的mRNA相对表达量均极显著升高(P<0.001或P<0.01),蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05)。综上表明,VTG2可促进WAT棕色化,对DEX诱导的肥胖具有抵抗作用,为治疗肥胖提供新的研究思路。

β_(2)-肾上腺素能受体通过β-抑制蛋白/细胞外调节蛋白激酶通路在病毒性心肌炎中的机制研究

目的:探究β_(2)-肾上腺素能受体(β_(2)-AR)通过β-抑制蛋白(β-arrestin)/细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路在病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌损伤中的可能作用机制。方法:将40只小鼠随机分为:对照组、VMC组、抑制β_(2)-AR组及抑制β-arrestin组,每组10只。超声心动图检测小鼠Tie指数、射血分数(EF)及左室短轴缩短率(FS)。HE染色检测心肌组织病理结构;Tunel试剂盒检测心肌凋亡水平;免疫荧光染色检测心肌组织β_(2)-AR、β-arrestin、ERK1/2蛋白水平;ELISA试剂盒检测血清肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量。结果:与对照组比较,VMC组小鼠Tie指数增加,EF、FS减少(均P<0.05),小鼠心肌组织结构疏松紊乱、炎性细胞大量浸润,心肌细胞凋亡增加,心肌组织β_(2)-AR、β-arrestin及ERK1/2表达增加,血清CK与AST含量增加(均P<0.05);与VMC组比较,抑制β_(2)-AR组小鼠Tie指数减少,EF、FS增加(均P<0.05),小鼠心肌组织损伤改善,心肌细胞凋亡减少,心肌组织β_(2)-AR、β-arrestin及ERK1/2表达减少。与VMC组比较,抑制β-arrestin组小鼠心肌组织β-arrestin及ERK1/2表达减少,血清CK与AST含量减少(均P<0.05)。结论:抑制β_(2)-AR可通过下调β-arrestin/ERK1/2通路改善VMC小鼠心功能异常及心肌损伤。

生存素、人类表皮生长因子受体2、巨囊性病液体蛋白15、Yes相关蛋白表达对乳腺癌患者术后复发转移的预测价值

目的:研究生存素(Survivin)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)、巨囊性病液体蛋白15(GCDFP15)、Yes相关蛋白(YAP)表达对乳腺癌患者术后复发转移的预测价值。方法:收集156例经乳腺癌改良根治术治疗的乳腺癌患者乳腺癌病理组织及癌旁正常组织,比较乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白表达情况;所有患者术后均随访2年,根据患者术后随访期间复发转移情况将其分为Ⅰ组(51例)和Ⅱ组(105例),统计两组一般资料,比较两组癌组织Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白表达情况,分析乳腺癌患者术后2年内复发转移的影响因素及癌组织Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白单一及联合检测对乳腺癌患者术后2年复发转移的预测价值。结果:癌组织Survivin、HER-2、GCDFP15阳性表达率高于正常组织,YAP阳性表达率低于正常组织(均P<0.05)。Ⅰ组低分化、临床分期Ⅲ期患者占比高于Ⅱ组(均P<0.05)。Ⅰ组癌组织Survivin、HER-2、GCDFP15阳性表达率高于Ⅱ组,YAP阳性表达率低于Ⅱ组(均P<0.05)。分化程度为低分化、临床分期Ⅲ期及Survivin、HER-2、GCDFP15蛋白阳性表达均为乳腺癌患者术后2年内复发转移的独立危险因素(OR=2.092、1.992、2.059、1.815、1.857,均P<0.05);YAP蛋白阳性表达为乳腺癌患者术后2年内复发转移的保护因素(OR=0.489,P<0.05)。癌组织Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白联合预测乳腺癌患者术后2年复发转移的曲线下面积(AUC)值高于四者单独检测(均P<0.05)。结论:乳腺癌的发生与Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白表达情况有关,且患者术后2年复发转移的发生与其分化程度、临床分期及Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白表达情况有关,同时Survivin、HER-2、GCDFP15、YAP蛋白联合可有效提高对乳腺癌患者术后2年复发转移的预测价值。

老年急性进展性脑梗死患者血清磷脂酶A2、S100钙结合蛋白B水平与颈动脉斑块的联系

目的探讨老年急性进展性脑梗死患者血清磷脂酶A2(PLA2)、S100钙结合蛋白B(S100B)和颈动脉斑块的关系。方法将2021年1月至2022年6月收治的120例老年急性进展性脑梗死患者纳入观察组,同期将115例非进展性脑梗死患者为非进展组,100例健康人员为健康组。将观察组分为无斑块组34例、斑块稳定组45例和斑块不稳定组41例。分析血清PLA2、S100B水平与颈动脉斑块的关系。ROC分析二者对颈动脉斑块的预测价值。随访1年,以复发和死亡为终点事件分析生存率。结果斑块稳定组、斑块不稳定组血清PLA2、S100B高于无斑块组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清PLA2、S100B与颈动脉斑块呈正相关。ROC显示二者联合预测的价值更高(P<0.05)。结论血清PLA2、S100B在老年急性进展性脑梗死患者水平升高,与颈动脉斑块关系密切。

基于真核表达塞内卡病毒A VP2蛋白的间接ELISA检测方法

为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2蛋白。以纯化的VP2蛋白为包被抗原,利用棋盘滴定法确定最优的抗原包被浓度和待检血清稀释度,通过优化反应条件和确定临界值,建立了检测SVA抗体的间接ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及与IFA的检测符合率。结果显示,重组VP2蛋白在杆状病毒感染的Sf9细胞内呈现可溶性表达,能够被SVA VP2特异性单克隆抗体2F5识别;经Ni-NTA纯化后,获得了分子量约31 kDa的重组VP2蛋白;间接ELISA的最佳抗原包被浓度为2μg/mL,最佳血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.287;与口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型抗血清无交叉反应;批内与批间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA检测了实验室保存的52份猪血清样本,与IFA的检测符合率为96.15%(50/52)。综上,本试验间接ELISA的成功建立为SVA抗体检测和流行病学调查提供了有力工具。

乌鳢白细胞衍生趋化因子LECT2互作蛋白的筛选与鉴定

为了解乌鳢(Channa argus)白细胞衍生趋化因子2(CaLECT2)在抗菌免疫过程中所调控的配体蛋白,克隆获得CaLECT2基因,并对其表达特征进行了分析。利用体内注射试验分析了CaLECT2对乌鳢机体的免疫增强作用。利用His-pull down联合质谱、Co-IP分析了CaLECT2的互作蛋白。结果显示,在感染鰤诺卡氏菌的乌鳢脾脏、肾脏和肝脏中,CaLECT2 mRNA的表达量显著上调。利用原核表达系统表达纯化获得了CaLECT2重组蛋白。通过Western Blot证明rCaLECT2抗血清可以特异性识别CaLECT2重组蛋白。向乌鳢体内注射CaLECT2蛋白可以显著提高脾脏内巨噬细胞数量。Pull down联合质谱鉴定得到Fetuin-like protein、Serotransferrin和CD209等253个潜在的互作蛋白。Co-IP结果进一步确认了CaLECT2与CD209存在互作关系。研究为深入探讨CaLECT2所调控的配体蛋白功能奠定了前期基础。

负载骨形态发生蛋白2水凝胶诱导牙髓干细胞的成骨分化

背景:前期研究证明,甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶支架可促进人牙髓干细胞的增殖及分化。水凝胶负载骨形态发生蛋白2被认为是骨修复中有前景的材料。目的:观察负载不同质量浓度骨形态发生蛋白2的甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶对人牙髓干细胞成骨向分化的诱导作用。方法:制备含0,50,100,200μg/mL骨形态发生蛋白2的甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶,分别记为GelMA/TDM、BMP-2(50 ng/mL)GelMA/TDM、BMP-2(100 ng/mL)GelMA/TDM、BMP-2(200 ng/mL)GelMA/TDM,检测复合水凝胶对骨形态发生蛋白2的体外缓释性能。采用改良组织块酶消化法提取人牙髓干细胞,分别接种于4种水凝胶表面,采用CCK-8法检测细胞增殖,DAPI染色检测细胞黏附;对各组水凝胶表面的人牙髓干细胞进行成骨诱导,进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测与茜素红染色,采用RT-PCR法检测相关成骨基因(Runx2、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原)表达。结果与结论:①甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶可持续释放骨形态发生蛋白2长达21 d,在第3-6天释放较快,第6天之后释放趋于平稳;②4种水凝胶均可促进人牙髓干细胞的增殖,其中以BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用最明显;相较于GelMA/TDM复合水凝胶,BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶可促进人牙髓干细胞的黏附,其中以BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用最明显;③相较于GelMA/TDM复合水凝胶,BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶可提升碱性磷酸酶活性、钙结节含量与相关成骨基因表达,综合分析显示BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用更明显;④结果表明,BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶促进牙髓干细胞成骨向分化的能力更明显。

贻贝启发接枝骨形态发生蛋白2成骨活性肽的介孔生物玻璃修复股骨髁缺损

背景:骨形态发生蛋白2在胚胎发育、骨骼形成和再生修复中具有重要作用,但高剂量应用与癌症发病密切相关。骨形态发生蛋白2成骨活性段L20能够有效减少癌症等不良反应,并可显著促进骨组织再生。目的:将骨形态发生蛋白2活性肽段以贻贝衍生肽模拟策略接枝在介孔生物玻璃表面,探究其对组织工程成骨性能的影响。方法:(1)采用模板法合成介孔生物玻璃纳米颗粒,采用一步法合成负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20的介孔生物玻璃纳米颗粒,表征负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔活性玻璃纳米颗粒的形貌与体外缓释性能。(2)分离提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,传2代后分别与PBS(空白组)、介孔生物玻璃纳米颗粒(对照组)、负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒(实验组)共培养,采用细胞活死荧光染色和CCK-8法检测细胞毒性和细胞增殖,扫描电镜观察细胞黏附;成骨诱导分化后,进行碱性磷酸酶染色、茜素红S染色与成骨相关基因表达检测。(3)取15只SD大鼠,建立双侧股骨髁缺损模型,采用随机数字表法分为3组:空白组(n=5)不植入任何材料,对照组(n=5)植入介孔生物玻璃纳米颗粒,实验组(n=5)植入负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒。术后8周,进行股骨Micro-CT扫描与组织形态观察。结果与结论:(1)扫描电镜下可见负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒为球形、单分散颗粒,透射电镜下可见其具有多孔结构,平均粒径为(268.10±0.58) nm,体外可缓释L20。(2)负载骨形态发生蛋白2成骨活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒无细胞毒性,并且可促进骨髓间充质干细胞的增殖与黏附;与空白组、对照组相比,实验组碱性磷酸酶活性与细胞外基质矿化能力均升高(P <0.05),碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素mRNA表达升高(P <0.05)。(3)股骨Micro-CT扫描结果显示,与空白组、对照组相比,实验组新生骨量与骨密度均升高(P <0.05);苏木精-伊红与Masson染色结果显示,与空白组、对照组相比,实验组新骨生成与胶原纤维均增加。(4)结果表明,负载骨形态发生蛋白2活性肽L20介孔生物玻璃纳米颗粒具有良好的生物相容性及体内外促成骨性能,可促进SD大鼠股骨髁缺损的再生修复。

血清锌α2糖蛋白联合高迁移率族蛋白B1对癫痫病人短期内再次发作风险的预测价值

目的探讨血清锌α2糖蛋白(ZAG)联合高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对癫痫病人短期内再次发作风险的预测价值。方法选取2022年2月至2023年2月唐山职业技术学院附属医院癫痫治疗后短期(1周)内再次发作的110例全面性发作癫痫病人作为观察组,另选取同期于唐山市协和医院癫痫治疗后短期内未再次发作的110例全面性发作癫痫病人作为对照组。Pearson法分析癫痫短期内再次发作病人血清ZAG和HMGB1表达水平的相关性,logistic回归分析影响癫痫病人短期内再次发作的相关因素,受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析血清ZAG和HMGB1对癫痫病人短期内再次发作的预测价值。结果观察组血清ZAG表达水平[(38.11±4.21)mg/L比(41.76±5.36)mg/L]低于对照组,血清HMGB1表达水平[(6.07±1.63)μg/L比(4.89±0.92)μg/L]高于对照组(P<0.05);癫痫短期内再次发作病人血清ZAG、HMGB1表达水平呈显著负相关(r=−0.80,P<0.05);观察组治疗前发作频率≥1次/月、多药联合治疗的病人所占比例均高于对照组(P<0.05);治疗前发作频率≥1次/月、多药联合治疗、HMGB1为癫痫病人短期内再次发作的危险因素,ZAG为保护因素(P<0.05);血清ZAG、HMGB1单独检测预测癫痫病人短期内再次发作的曲线下面积(AUC)分别为[0.73,95%CI:(0.68,0.77);0.73,95%CI:(0.69,0.77)],二者联合检测的AUC为0.79,95%CI:(0.75,0.83),优于血清ZAG、HMGB1各自单独检测(Z_(二者联合-ZAG)=3.10、Z_(二者联合-HMGB1)=2.75,P=0.002、0.005)。结论血清ZAG、HMGB1表达水平与癫痫病人短期内再次发作密切相关,二者联合检测对癫痫病人短期内再次发作具有较高的预测效能。

卷曲螺旋结构域蛋白2通过促进线粒体自噬抑制帕金森病SH-SY5Y细胞凋亡

背景:卷曲螺旋结构域蛋白2(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing 2,CHCHD2)能否调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在帕金森病中发挥神经保护作用尚未可知。目的:探讨CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中对PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬发挥的作用及机制。方法:利用重组质粒转染技术过表达或敲低CHCHD2,用6-羟基多巴胺构建SH-SY5Y细胞帕金森病模型后分对照组、模型组、过表达阴性对照+6-羟基多巴胺组、敲低阴性对照+6-羟基多巴胺组、过表达CHCHD2+6-羟基多巴胺组和敲低CHCHD2+6-羟基多巴胺组。Western blot及RT-qPCR检测CHCHD2的表达;Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、MFN1、COXⅣ、DRP1、PINK1、Parkin、TIM23、Bax、Bcl-2及cleavedcaspase3蛋白表达;CCK-8、JC-1和活性氧试剂盒检测细胞活性、线粒体膜电位和活性氧水平,单丹磺酰尸胺染色观察细胞自噬情况,透射电镜观察自噬溶酶体。结果与结论:①与对照组相比,模型组细胞活性、线粒体膜电位及CHCHD2、PINK1、Parkin蛋白表达降低,活性氧水平、凋亡水平及LC3Ⅰ/Ⅱ、p62蛋白表达升高(P<0.05),并观察到自噬溶酶体的存在;②与模型组相比,过表达CHCHD2能降低细胞活性氧水平,升高线粒体膜电位及PINK1、Parkin和MFN1蛋白表达水平,并观察到线粒体自噬溶酶体增多,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用,并伴有COXⅣ、TIM23和p-DRP1蛋白表达的升高(P<0.05);③与模型组相比,过表达CHCHD2能减少细胞凋亡,上调Bcl-2并下调Bax及cleavedcaspase3蛋白的表达,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用(P<0.05);④结果提示,CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中可以通过促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬改善线粒体功能从而减轻细胞凋亡发挥神经保护作用。

Eps15同源结构域蛋白2在结肠癌细胞侵袭、转移中的作用及其初步机制

目的探究Eps15同源结构域蛋白2(Eps15 homology domain-containing protein 2,EHD2)在结肠癌细胞中的作用及其分子机制。方法在SW620细胞系中构建过表达EHD2的细胞模型,检测EMT相关标志分子物的变化,研究过表达EHD2对细胞株的生物学行为包括转移、侵袭、增殖及凋亡的影响。最后运用异种移植肿瘤模型验证过表达EHD2对裸鼠体内结肠癌的发生及发展的影响。结果过表达EHD2会抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭及促进凋亡;在裸鼠体内,过表达EHD2可以抑制裸鼠皮下肿瘤的生长;且EHD2与EMT相关标志物的表达呈正相关,推测EHD2通过抑制EMT途径抑制结肠癌的进展。结论EHD2可能作为抑癌基因通过EMT进程抑制结肠癌的侵袭和转移。