Luminex液相芯片的发展及应用

液相芯片技术是20世纪90年代兴起的,集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术。它的最大特点是通量大、灵活性好。Luminex公司利用液相芯片技术先后推出了Luminex 100、Luminex 200和Flexmap 3D液相芯片检测平台。现对Luminex液相芯片的发展、原理及应用作一简介。

6种人兽共患病病原核酸液相芯片检测体系的建立

本研究通过设计、合成特异性引物和探针并对其进行修饰,将探针和特定荧光编码微球共价交联后,利用Luminex检测仪读取荧光信号,从而建立了针对布鲁氏菌、沙门氏菌、弓形虫,狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌等6种病原的液相芯片检测方法。数据显示,本研究建立的液相芯片检测体系具有良好的特异性,检测灵敏度达50拷贝数,能同时检测6种重要人兽共患病病原,对于这6种人兽共患病的快速筛查和控制提供了技术支撑。

4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血热病毒（EHDV）、阿卡斑病毒（AKV）、蓝舌病病毒（BTV）和水泡性口炎病毒（VSV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中BTV的VP7基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和VSV的NP基因序列进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针并标记生物素,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与这些病毒相应基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪（Liquichip 200）检测荧光信号建立了以上4种虫媒病的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到50~100个TCID50。本研究建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术,为其他类似病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用

液相芯片技术是以100种不同荧光编码的微球作为探针的载体,生物分子间的反应在悬浮液态体系中进行的一类新的生物芯片技术.在这个灵活和开放的平台中可进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测.液相芯片较传统的固相芯片的优势在于检测准确、信息质量稳定、可重复性好.液相芯片以其易于操作、高通量、高灵敏度、高准确度、高精密度以及宽的线性测定范围的特点,逐渐进入了临床诊断领域.

西尼罗热液相芯片快速检测方法的初步建立

用DNAStar软件对GenBank中西尼罗热病毒(WNV)的E基因进行序列分析,设计WNV特异性探针并标记生物素,与荧光编码微球偶联后与病毒E基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号建立WNV快速液相芯片检测方法。结果表明:该法具有较好的特异性,不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到100个拷贝。说明初步建立了检测WNV的液相芯片技术,这为进一步搭建WNV全新快速高通量检测平台奠定基础,也为其他同类病毒的快速高通量检测提供借鉴和经验。

丙型肝炎病毒核酸液相芯片分型检测方法的建立及应用

目的建立丙型肝炎病毒1a、1b、2a、3a、3b、6a亚型的核酸液相芯片分型检测方法。方法建立PCR扩增及核酸探针偶联方法,将PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,建立液相芯片检测方法,并对建立的液相芯片检测方法进行灵敏度及特异性评价,应用该方法对93份血清样本核酸进行检测。结果建立的丙型肝炎病毒核酸液相芯片分型检测方法具有较高的特异性和敏感性,能对6种亚型进行检测和分型,对于HCV 1a、3a和6a亚型核酸液相芯片分型检测方法的灵敏度为1×105copies/PCR;对于HCV-1b、2a和3b亚型核酸液相芯片分型检测方法的灵敏度为1×104 copies/PCR。对93份临床样本的检测结果表明,该方法具有高通量、快速、敏感、特异的特点。结论本方法能对丙型肝炎病毒的6种亚型进行同时快速检测,为丙型肝炎病毒的分型检测提供一种新方法。

促甲状腺激素液相芯片检测法的建立和方法学评价

目的建立用液相芯片技术测定促甲状腺激素（TSH）的方法，对其方法学和临床应用价值作评价。方法通过抗TSH的单抗交联单色荧光微球，采用标记有生物素的另一配对抗TSH的单抗以及由藻红蛋白（PE）标记的亲合素组成相应的荧光报告系统，用液相芯片仪Luminex100检测待检标本荧光强度，通过TSH标准浓度绘制出标准TSH浓度荧光强度剂量曲线。用液相芯片技术测定100份临床血清标本的TSH浓度并与拜尔的化学发光法的测定结果做方法学比较。结果液相芯片技术测定TSH的线性范围为0．3～162μIU／mL，高、中、低3个浓度的批内精密度为10．00％、6．91％、17．80％。高、中、低3个浓度的回收率为94．3％、96．7％、95．2％。与拜尔的化学发光法的相关系数为0．965（P=8．77×10^-57）。结论本研究建立的液相芯片技术在TSH测定中的主要技术指标与拜尔的化学发光法相近，有临床应用价值。

转基因玉米Bt176液相芯片检测方法的建立

为建立转基因玉米Bt176的液相芯片检测方法,根据已公布的转基因玉米Bt176外源插入基因CaMV35S启动子序列,外源基因3'端与玉米基因组DNA连接区序列,同时以玉米特异Zein内源基因序列为参照,利用Primer Premier5.0等软件设计特异性引物和探针。将探针与荧光编码微球偶联后,与PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Bio-plex 200)检测荧光信号。检测结果显示,该方法具有高特异性及灵敏度,各条探针之间无交叉反应,最低检测限可达0.01%。初步建立了检测转基因玉米Bt176的液相芯片技术,为其他转基因作物的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中EHDV的VP7基因进行序列分析,设计EHDV特异性探针并用生物素标记,与荧光编码微球偶联后与病毒VP7基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip200)检测荧光信号建立了EHDV快速高通量液相芯片检测方法。检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度为100个TCID50。建立了快速检测EHDV的液相芯片技术,为进一步搭建EHDV快速高通量检测平台奠定了基础。

Luminex液相芯片同时检测tPSA和fPSA方法的建立与评价

目的建立用Luminex液相芯片技术同时测定前列腺特异性抗原（total prostate specific antigen,tPSA）和游离前列腺特异性抗原（free prostate specific antigen,fPSA）的方法,并对该方法进行评价。方法制备抗体交联微球及藻红蛋白标记二抗,用双抗体夹心法对临床血清标本进行测定,并与ELISA方法进行比较。结果Luminex液相芯片技术同时测定tPSA、fPSA与ELISA测定结果高度相关。Luninex方法测定tPSA的灵敏度为0.03 ng/L,批内精密度为4.38%~5.86%,批间精密度为3.40%~6.73%;测定fPSA的灵敏度为0.013 ng/L,批内精密度为5.08%~7.94%,批间精密度为3.77%~5.74%。结论Luminex方法同时测定tPSA、fPSA具有灵敏度高、重复性好、系统误差小等优点,具有广泛的临床应用前景。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均<10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。

慢性充血性心力衰竭患者血清基质金属蛋白酶的液相芯片检测

目的探讨慢性充血性心力衰竭(CHF)患者血清基质金属蛋白酶(MMPs)的变化。方法CHF患者15例,正常对照组15例,采用Luminex液相芯片分析平台测定血清MMP-3及MMP-9的含量。结果CHF患者血清MMP-3,MMP-9的含量比正常对照组明显增加(P<0.05)。结论CHF患者血清MMP-3,MMP-9含量增高,与心室重构有关。

液态芯片技术分析RA患者血清免疫复合物对滑膜细胞分泌细胞因子的影响

目的用液态芯片技术研究类风湿关节炎(RA)患者血清免疫复合物(IC)对关节成纤维样滑膜细胞(FLS)分泌细胞因子的影响。方法用聚乙二醇(PEG)沉淀法分别提取10份抗环瓜氨酸肽抗体(ACCP)阳性的RA患者及健康人对照血清IC,间接ELISA法测定IC中ACCP特异性IC水平。体外培养RA患者关节FLS,分别用RA患者ACCP-IC阳性IC(ACCP+-IC)、ACCP-IC阴性IC(ACCP--IC)及健康人对照血清IC(C-IC)刺激FLS,培养24 h后,用液态芯片技术检测不同来源IC刺激对FLS分泌IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、TNF-α、GM-CSF、EGF、VEGF等11种细胞因子水平的影响。结果 10份RA患者血清中提取的IC,包括ACCP+-IC 6份和ACCP--IC 4份,刺激FLS 24 h后,可诱导细胞分泌大量IL-6、IL-8和GM-CSF;其中ACCP+-IC组刺激FLS分泌GM-CSF和IL-8水平均显著高于ACCP--IC组。3组刺激物组刺激分泌IL-1β、IL-2、IL-10、IL-15、IL-17、TNF-α、EGF、VEGF等其他8种细胞因子含量均无显著性差异。结论 ACCP+-IC具备更强的促FLS分泌GM-CSF、IL-6和IL-8的活性。

基于锁式探针技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌

目的:建立一种检测玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌的方法,为同时检测这2种检疫性细菌提供技术手段。方法:基于靶标序列设计2种检疫性细菌的锁式探针,与靶标菌进行连接消化反应,然后采用通用引物进行滚环扩增,其产物与偶联上对应捕获探针的微球进行杂交,最后通过液相悬浮芯片二重检测。结果:该检测方法能够有效地检测2种检疫性细菌,其检测阈值为103CFU/m L,具有良好的可重复性。结论:建立了一种快速、灵敏的玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌的二重检测方法。

肺癌与HPV感染相关性的初步研究

目的:应用液相芯片技术分析肺癌患者与HPV感染的相关性.方法:重组质粒表达HPV16 E6和E7蛋白,同微球偶联后作为抗原,应用Luminex系统检测肺癌患者血清中的相应抗体.结果:肺癌组HPV16 E6/E7抗体水平显著高于正常对照组,肺鳞状细胞癌与腺癌肿瘤组对比,肺鳞状细胞癌HPV16E6/E7抗体阳性率显著高于肺腺癌组,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:HPV感染与肺鳞状细胞癌具有一定的相关性,为进一步研究肺鳞状细胞癌发生的分子机制提供了依据.

抗癌胚抗原抗体的交联浓度对液相芯片荧光检测信号的影响

目的探讨不同交联浓度的抗癌胚抗原（CEA）单克隆抗体对液相芯片荧光检测信号的影响，明确CEA检测中最适抗体交联浓度。方法分别以不同交联浓度的标记有生物素的抗-CEA单抗与Luminex公司生产的44号荧光微球交联，交联完成后在每个反应孔中加入交联有不同浓度抗体的荧光微球各5000个，每个浓度加8孔，在每个抗体交联浓度下对应的检测孔中分别加入藻红蛋白（PE）标记的亲和素，经过15min的反应后用Luminex-100荧光检测仪检测荧光强度。结果CEA抗体的最适交联浓度为100μg／ml。结论在液相芯片的蛋白检测中CEA抗体有其最适的交联浓度。

眼眶炎性假瘤中IL-1β和IL-6表达的研究

目的探讨炎性因子与眼眶特发性炎性假瘤(IOIP)的关系。方法利用目前最先进的基因芯片和蛋白液相芯片检测IOIP样本和正常样本中IL-1β基因水平和IL-1β、IL-6蛋白水平。结果与正常对照组相比,IOIP组IL-1β基因和蛋白水平均明显升高;两组间IL-6蛋白水平无统计学差异。结论炎症因子IL-1β与IOIP发病相关。

红霉素对烟草烟雾提取物作用下人巨噬细胞释放相关炎症因子的影响

目的:研究红霉素(EM)对烟草烟雾提取物(CSE)作用下人巨噬细胞释放相关炎症因子的影响。方法:体外培养人类单核细胞系U937细胞,在细胞培养液中加入佛波酯(PMA)将其诱导分化为人巨噬细胞。将细胞分为3组:对照组、CSE组、EM+CSE组。CSE组用1%浓度CSE刺激24h,EM+CSE组用1mg/L EM预处理24h后,用1%浓度CSE刺激24h。用液相芯片技术检测各组细胞上清液中嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、白介素(IL)-17A、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-8、MIP-1α、IL-1β、IL-6含量。结果:CSE显著促进人巨噬细胞释放eotaxin、IL-17A、MIP-1β、MCP-1、IL-8、MIP-1α、IL-1β、IL-6(P<0.05),而EM能抑制CSE引起的上述炎症因子释放增加(P<0.05)。结论:EM可能通过抑制CSE刺激引起的人巨噬细胞释放eotaxin、IL-17A、MIP-1β、MCP-1、IL-8、MIP-1α、IL-1β、IL-6等细胞因子,抑制烟草烟雾暴露相关疾病进展。

同时检测八种HCV亚型的方法研究

目的建立丙型肝炎病毒八种亚型的液相芯片分型检测方法。方法通过建立多重PCR扩增、核酸探针偶联及杂交检测方法,建立液相芯片分型检测方法,并评价所建立的方法。结果建立的基于液相芯片技术的丙型肝炎病毒分型检测方法能对八种亚型进行检测和分型,具有较高的特异性和敏感性。对142份临床样本的检测结果表明,该方法具有高通量、快速、敏感、特异的特点。结论本研究建立的方法能实现对丙型肝炎病毒八种亚型的同时快速检测,是丙型肝炎病毒分型检测的一种新方法。

液相芯片技术同时检测对虾桃拉病毒和虾黄头病毒的研究

为建立一种同时检测对虾桃拉病毒、虾黄头病毒的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中对虾桃拉病毒的CP2基因和虾黄头病毒的N基因进行序列分析,设计对虾桃拉病毒、虾黄头病毒特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰,与荧光编码微球偶联后与对虾桃拉病毒、虾黄头病毒病毒RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。该检测体系对对虾桃拉病毒、虾黄头病毒病毒核酸检测灵敏度高,其最低检测限为100pg,且与白斑病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒核酸等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,为同时快速检测对虾桃拉病毒、虾黄头病毒提供了简捷快速的技术手段。