基于流式量子点微球技术的甲乙型流感病毒抗原检测方法的建立和初步应用分析

目的建立基于流式量子点微球技术的甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)抗原联检方法,为常见呼吸道病毒抗原多重检测打下基础。方法分别使用自制的不同量子点编码微球和小鼠抗FluA/FluB核蛋白(NP)单克隆抗体进行偶联,在流式细胞仪上对已知浓度的甲乙型流感病毒抗原分别和同时进行检测,对检测条件进行优化,建立甲乙型流感病毒抗原联检方法,利用此方法对临床样本进行检测,与实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR,qPCR)进行比对,验证此方法的临床性能。结果建立了甲乙型流感病毒抗原联检方法,该方法的甲乙型流感病毒抗原的检出限分别为26.1 pg/ml和10.7 pg/ml,测量范围均为15.3~250000 pg/ml。对临床样本检测,与qPCR比对一致性良好,阳性符合率为57.4%,阴性符合率为100%,总符合率71.6%,并优于临床常用胶体金试剂(阳性符合率为56.49%,阴性符合率为99.75%)。结论此流式量子点微球多重检测方法可以用于甲乙型流感病毒抗原的联检,其灵敏度较高、特异度好、检测范围广,可以为呼吸道常见病毒多重检测打下良好基础,在临床上具有应用前景。

液相与固相蛋白芯片检测多肿瘤标记物的应用比较

[目的]比较液相与固相蛋白芯片检测多肿瘤标记物的临床应用效果,并探讨液相蛋白芯片应用于临床检验的可行性。[方法]分别用液相与固相蛋白芯片方法检测45例临床送检样本的AFP、CA125、CA242及CEA,对两种方法的操作步骤、有效检测范围、参考临界值及检测结果进行比较。[结果]与固相蛋白芯片相比,液相蛋白芯片检测多肿瘤标记物的操作至少节省1h,标本用量节省80μl,线性范围至少增大1倍;两种方法检测AFP、CA125、CA242及CEA的参考临界值相同,阴阳性判断结果的符合率分别为97.78%(44/45)、86.67%(39/45)、88.89%(40/45)、86.67%(39/45)。统计学分析表明两种方法检测的阴阳性结果无明显差异。[结论]液相蛋白芯片检测多肿瘤标志物具有操作简便、标本用量少、线性范围广、准确度高的优点,可推广应用于临床检验。

液体芯片-飞行时间质谱对结膜松弛症患者泪液蛋白质的分析

目的应用液体芯片-飞行时间质谱系统分析结膜松弛症患者的泪液蛋白质表达谱,寻找潜在具有结膜松弛症诊断意义的生物学标志物。方法收集10例结膜松弛症患者和9例正常对照的泪液,利用毛细管法每眼收集15μL泪液。经ClinProt磁珠纯化、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析及ClinProTools生物信息学软件研究其泪液蛋白表达谱,比较2组人群泪液蛋白质谱表达的差异。结果 2组共检测发现了77个蛋白质峰,其中13个蛋白质峰差异有统计学意义(P<0.05)。其中质荷比(m/z)为1 632.48和3 401.87者为差异蛋白质,能较好地鉴别结膜松弛症组和正常对照组。结论液体芯片-飞行时间质谱系统可高效、精确地筛查泪液蛋白质。结膜松弛症组与正常对照组泪液蛋白存在差异,值得进一步研究,可能对发现结膜松弛症的发病机制和寻求有效的防治手段有指导作用。

液相蛋白质芯片检测血清C反应蛋白方法的建立

目的建立液相蛋白质芯片检测血清C反应蛋白(CRP)的方法,探讨该方法诊断冠心病的临床应用价值。方法用聚苯乙烯荧光微珠,将抗CRP单克隆抗体包被在微珠上,将另一针对CRP不同抗原表位的单克隆抗体生物素化;包被好的微珠加入到96孔板中,将待测血清分别加入各孔,用CRP标准品建立标准曲线,各孔中加入生物素化抗CRP单抗和PE荧光素标记的链霉亲合素。在Bio-Plex液相蛋白质芯片分析仪上检测296份血清样品。同一血清标本同时用免疫比浊法测定。比较两种方法对CRP检测的敏感性和特异性。结果液相蛋白质芯片检测CRP方法对诊断冠心病的敏感性(78.3%)和特异性(87.1%)较免疫比浊法的敏感性(63.0%)和特异性(86.5%)高,χ2=28.94,P<0.001。结论建立了一种检测血清CRP的新方法,对诊断冠心病有临床应用价值。

基于蛋白芯片的慢性肾衰舌苔上清液中蛋白研究

目的:通过比较慢性肾衰(CRF)患者与正常对照组人群舌苔上清液中蛋白表达谱的差异,筛选慢性肾衰舌苔蛋白标志物并建立预测模型,探讨其在慢性肾衰诊断中的意义。方法:对67例慢性肾衰患者和38例正常对照组人群舌苔上清液样本,运用SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术筛选慢性肾衰舌苔蛋白标志物,经生物信息学分析建立预测模型并进行验证。结果:①慢性肾衰组67例和正常对照组38例舌苔样本经SELDI-TOF-MS技术测定,质荷比1000～20000范围内共检测到242个蛋白峰,经生物信息学统计分析,有13个差异质谱峰有统计学意义(P<0.01),其中m/z 1092.68、m/z 1508.26等7个差异质谱峰在慢性肾衰组中呈高表达;m/z 13302.5、m/z 14330.7等6个差异质谱峰在慢性肾衰组中呈低表达。②利用层次聚类算法进行层次聚类分析和主成分分析(PCA),结果显示,慢性肾衰组与正常对照组样本之间区分较明显,但均存在部分重叠。③经生物信息学分析建立慢性肾衰预测模型,最终得到m/z 1049.61、m/z 1076.94、m/z 15295.7等7个差异质谱峰组成的生物标记物可以将慢性肾衰组和正常对照组样品较好的分类(最终预测模型的灵敏度为61.4%,特异度为57.3%,预测正确率为64.4%)。结论:该研究运用SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术,初步筛选出了慢性肾衰舌苔蛋白标志物并建立了预测模型,为慢性肾衰的诊断研究提供客观依据。

蛋白质组学研究的分离技术及其进展

蛋白质的分离技术是蛋白质组学研究的核心技术 ,目前应用于蛋白质分离的方法主要包括二维电泳分离技术、液相色谱 质谱分离技术以及蛋白质芯片。作者通过文献复习 ,对以上三种技术的基本原理。

蛋白质组学技术研究进展

随着现代科学技术的飞速发展,现代生物学技术已经发展到后基因组时代,包括人类在内的几十种生物体基因组测序已经完成,生命科学研究的重点从结构基因组研究转移到后基因组时代——功能基因组的研究,蛋白质组学研究是功能基因组一个重要的组成部分。因此,与之相适应,蛋白质组学研究技术也是日新月异,层出不穷,除了最经典的二维凝胶电泳技术,多维液相色谱技术,同位素标记亲和标签技术相继发展起来,蛋白质芯片技术及噬菌体展示技术也得到了较为广泛的应用。本文针对蛋白质组学研究上述关键技术进行了综述。

移植前胚胎培养液IL-8在评价胚胎质量和妊娠结局中的价值

目的:探讨移植前人胚胎培养液中白细胞介素-8(IL-8)在评价胚胎质量和妊娠结局中的价值。方法:选取330例行体外受精-胚胎移植(IVF/ICSI)前胚胎培养液标本作为研究组,再将研究组分为IL-8阳性组(IL-8>0.19 ng/L)和IL-8阴性组(IL-8≤0.19 ng/L);另选9例没有放置胚胎的培养液作为阴性对照;采用液相芯片高通量蛋白质分析技术(LHTPA)测定培养液中IL-8含量,比较阴性对照组、IL-8阳性组和IL-8阴性组移植前人胚胎培养液中IL-8水平,比较IL-8阳性组和IL-8阴性组孕妇的年龄、不孕时间、病因(原发不孕、继发不孕及输卵管因素)、胚胎移植周期数、获卵数、移植胚胎数及妊娠期失访率,比较普通胚胎和优质胚胎移植组被检者移植前胚胎培养液中IL-8阳性和阴性构成及妊娠率,比较IL-8阳性组和IL-8阴性组妊娠率、临床妊娠率、种植率、生化妊娠率、流产率、活产率及活婴出生例数与接受胚胎移植患者总例数比值(NLBPP)。结果:研究组IL-8的阳性率为32.42%,IL-8阳性组中IL-8水平高于阴性对照组和IL-8阴性组(P<0.05);IL-8阳性组和IL-8阴性组被检者的年龄、不孕时间、病因(原发不孕和继发不孕)、胚胎移植周期数、注射HCG日的子宫内膜厚度、获卵数、移植胚胎数和妊娠期失访率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);IL-8阳性组和IL-8阴性组移植优质或普通胚胎构成比比较,差异无统计学意义(P=0.76);IL-8阳性组移植优质胚胎的妊娠率高于IL-8阴性组(P=0.02),而移植普通胚胎的妊娠率,差异无统计学意义(P=0.82),IL-8阳性组患者妊娠率、胚胎种植率显著高于IL-8阴性组(P<0.05);其余指标比较差异无统计学意义(P≥0.05)。结论:移植前人胚胎培养液中IL-8可作为评价胚胎发育潜能的指标。

液相蛋白芯片检测三种肿瘤标志物反应模式的建立及方法学评价

目的建立用液相蛋白芯片检测人血清三种肿瘤标志物的反应模式，并对其进行方法学评价。方法将癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和总前列腺特异性抗原（tPSA）的包被抗体分别交联于不同荧光编码的微球上，并自行制备生物素标记抗体和抗原标准品，建立双抗体夹心反应模式，评价液相蛋白芯片的检测范围、最低检测限、精密度等指标；将检测结果与化学发光免疫分析（CLIA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）进行相关性分析。结果CEA、AFP、tPSA的线性范围分别为0．063～200、0．052—66．6、0．008～10ng／ml；最低检测限分别为31．3、13．0、5．2pg／ml；批内变异系数（cv）为6．2％～9．1％，批间CV为7．5％-13．5％；检测100（109）份临床血清标本的灵敏度为96．2％～98．2％，特异度为97．7％～98．2％，准确度为97％-98％；液相蛋白芯片与CLIA及TRFIA结果均呈明显正相关，P均〈0．001。结论液相蛋白芯片检测多种肿瘤标志物具有线性范围广、灵敏度高、重复性好、操作简便、标本用量少等优点，具有临床应用潜力。

粪便蛋白Luminex液相芯片检测系统构建及其对结直肠肿瘤早期诊断的价值

目的基于Luminex液相芯片检测系统构建粪便人源性蛋白诊断体系,并评估其对结直肠肿瘤的早期诊断价值。方法收集2021年1月~2023年1月蚌埠医学院第一附属医院收治的结直肠癌(CRC)患者70例为CRC组、结直肠腺瘤(CRA)患者42例为CRA组,以及同期健康对照(HC)受试者38例为HC组。收集各组受试者粪便,使用Tris-Hcl缓冲液提取粪便总蛋白,通过Luminex液相芯片检测技术分析3组受试者粪便中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、人源性视黄醇结合蛋白4(RBP4)、甲壳素酶-3样蛋白1(CHI3L1)和补体成分3a(C3a)的水平差异;收集受试者外周血,分离血清检测癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)的水平;使用受试者工作曲线(ROC)分析MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a联合以及CEA和CA19-9联合对CRC、CRA、CRC和CRA的诊断效能,并比较两种组合诊断效能的差异。结果CRC组患者粪便中MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a水平均显著高于HC组(P<0.05),CRC组粪便中MMP-9和CHI3L1水平显著高于CRA组(P<0.05),但是RBP4和C3a在CRC和CRA组间并无显著性差异(P>0.05);另外,CRC患者外周血中CEA和CA19-9水平均显著高于HC组和CRA组(P<0.05),但是CRA组和HC组之间无显著性差异(P>0.05)。ROC曲线分析显示,MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a联合诊断CRC的灵敏度为91.4%,特异度为100.0%,联合诊断CRA的灵敏度为81.0%,特异度为89.5%,联合诊断CRC和CRA的灵敏度为83.9%,特异度为97.4%。Z检验比较分析显示,粪便蛋白MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a联合诊断CRC,CRA以及CRA和CRC的效能显著优于外周血肿瘤标志物CEA和CA19-9(P<0.05)。结论Luminex液相芯片检测粪便人源性蛋白RBP4、MMP-9、CHI3L1、C3a对结直肠肿瘤早期诊断具有价值且优于外周血肿瘤标志物CEA和CA19-9,具有较高的临床应用推广意义。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

【目的】实现A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列(登录号:KY747514.1),基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度(MFI),从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1蛋白与荧光微球偶联,阴性对照(背景)的平均荧光值为17(<100)。测试孔的平均MFI为2339.5(>2000),证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。

基于核酸适配体的微流控芯片酶反应器用于蛋白质的分析

将核酸适配体作为胰蛋白酶固定化介质,制备了一种新型的微流控芯片酶反应器,并与高效液相色谱-串联质谱联用,搭建了在线分析平台;分别使用标准蛋白及混合蛋白样品对芯片的酶解效率及联用平台的分析能力进行了初步评价。结果表明,5 ng肌红蛋白经该平台分析后肽段覆盖率可达到37%;对500 ng混合蛋白进行3次平行分析,肽段覆盖率及相对标准偏差分别为44.3%、6.5%(牛血清白蛋白),65.0%、2.7%(肌红蛋白)和62.0%、5.6%(细胞色素c);初步实验表明,该在线分析平台具有检测灵敏度高、重现性好、酶解效率高的特点,有望在蛋白质组学分析中发挥重要作用。

通过网络药理学和蛋白芯片研究鳖甲煎口服液抗肝纤维化的潜在机制

目的 通过网络药理学和蛋白芯片研究鳖甲煎口服液抗肝纤维化的潜在机制。方法 鳖甲煎口服液的化学成分、潜在靶点及肝纤维化相关基因均来自开放源数据库。然后,利用Autodock vina对目标蛋白和化合物进行分子对接。利用PyMOL对对接构象进行可视化。随后用蛋白芯片比较AngⅡ诱导的人肝星状细胞(HSC-LX2)和鳖甲煎口服液处理的HSC-LX2磷酸化蛋白(DEPs),以验证上述结果。结果 鳖甲煎口服液抗肝纤维化的网络药理学GO和KEGG通路富集分析结果表明,关键信号通路为PI3K/Akt、MAPK和Ras信号通路。分子对接的结论表明,活性物质(β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚)对关键靶点(TNF、AKT1、IL6)具有较高的亲和力。同时网络药理学的结果与蛋白芯片的结果相吻合。结论 鳖甲煎口服液治疗肝纤维化主要抑制Ras信号通路的活性,进而抑制MAPK和PI3K/Akt信号通路,包括抑制TNF、AKT1和IL6。上述通路蛋白还与鳖甲煎口服液具有活血化瘀、软坚散结的作用有关。这些途径可作为肝纤维化的治疗靶点。

非洲猪瘟病毒P30蛋白的表达及抗体液相芯片检测方法的建立

本研究旨在为建立高效、快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的抗体液相芯片检测方法。首先构建pET-28a-p30表达载体,利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统表达ASFV重组P30蛋白,然后将重组P30蛋白与羧基化的荧光微球偶联,建立ASFV P30抗体液相芯片检测方法。经鉴定,重组质粒成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以包涵体形式表达,Western blot结果显示重组P30蛋白可以与ASFV阳性血清产生特异性反应,证明其具有良好的反应原性。建立的ASFV抗体液相芯片检测方法检测中值荧光强度(median fluorescent intensity,MFI)阈值为1575.7,最佳结合蛋白浓度为每1.25×10^(6)个微球6μg,最佳血清稀释度为1∶600,最佳二抗浓度为1μg·mL^(-1),该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。用建立的方法和商品化ELISA试剂盒同时对92份临床采集的猪血清样本进行检测,结果显示二者符合率为92.39%。本研究成功表达重组P30蛋白,并建立了ASFV P30抗体液相芯片检测方法,为ASFV感染早期的血清学检测提供了新的方法,也为多种病原体的抗体检测奠定了基础。

5种重要虫媒病毒液相蛋白芯片多重检测方法的建立及应用

目的建立森林脑炎、乙型脑炎、登革热、基孔肯雅和刚果-克里米亚出血热5种虫媒病毒的液相蛋白芯片检测方法,为虫媒病毒的筛查检测提供一种新方法。方法将病毒抗原包被微球,采用间接法原理,利用病毒抗体和阳性血清建立并优化5种虫媒病毒液相蛋白芯片检测方法。对临床样本进行检测,评价液相蛋白芯片方法的敏感性、准确性。结果以病毒抗体和阳性血清建立的5种虫媒病毒液相蛋白芯片检测方法,病毒抗体及生物素标记二抗的孵育时间均为1 h,生物素标记羊抗兔/鼠/人Ig G的最佳稀释度为1∶100,能对5种虫媒病毒进行准确检测。该方法具有高通量、快速、敏感、特异等特点。结论本研究所建立的5种虫媒病毒液相蛋白芯片检测方法,可用于这5种虫媒病毒的同时筛查检测,适用于国境口岸对虫媒病毒进行筛查检测,能提高检测的效率,满足口岸检疫中快速检验的要求。

H1与H3亚型猪流感病毒IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法的建立

有效防治猪流感需要借助于准确而快速的检测方法,为了建立一种高效、快速的多重检测方法,本研究应用H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白抗原偶联不同编码的荧光微球,应用间接法检测模式,建立了H1、H3亚型猪流感病毒IgG抗体荧光微球免疫学检测方法,并将该方法与血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验(VN)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较分析。结果表明,该方法的抗体检测灵敏度比ELISA方法高100～1 000倍;与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒及日本乙型脑炎病毒的阳性血清均无交叉反应,且两种亚型血清之间也不存在交叉反应。重复性试验表明,批内和批间精密度测试结果分别为10.2%和12.8%。与HI、VN和ELISA方法比较,总符合率分别为97.82%、98.27%和97.83%。综上,本研究建立的检测方法具有双重检测特性,特异性好、灵敏性高、重复性强,可用于H1、H3亚型SIV的鉴别诊断。

应用液态悬浮芯片技术建立肝癌血清标志物蛋白GP73的检测方法

目的构建高尔基体糖蛋白73(GP73)的液态芯片检测体系并评价其检测性能。方法制备并纯化5株抗GP73的单克隆抗体,采用酶联免疫吸附试验双抗夹心法进行抗体配对筛选。应用筛选到的抗体对构建Luminex液态芯片检测体系,并对该检测体系进行分析性能评估。应用该体系检测正常对照、慢性乙型肝炎和肝细胞癌血液样本各30例,比较3组间GP73浓度的差异。结果制备并纯化了5株抗GP73单克隆抗体,配对筛选成功5对。应用8F10D1和10B9F11抗体对成功构建了GP73的Luminex液态芯片检测体系。该检测体系的灵敏度为0.25 ng/ml,线性检测范围为0.25~100 ng/ml,特异度较好,批内精密度<8%,批间精密度<9%,回收率为83%~92%,线性稀释效应的线性回归方程为y=1.141x+6.436(r2=0.998 4,P<0.001)。正常对照组、慢性乙肝组和肝细胞癌组血液样本的GP73浓度分别为42.8(38.68,55.90)ng/ml、61.49(43.59,81)ng/ml和122.78(49.36l,264.55)ng/ml。肝细胞癌组的GP73浓度高于慢性乙肝组和正常对照组(均P<0.05),慢性乙肝组的GP73浓度高于正常对照组(P<0.05)。结论成功构建了GP73的液态芯片检测体系,为GP73检测在临床上的应用奠定了基础。

干扰素-γ在临床常见血流感染小鼠模型中的表达及意义

目的 探讨干扰素-γ(IFN-γ)在9种临床常见的单病原菌性血流感染小鼠模型中的动力学变化及在区分不同病原菌感染中的价值。方法 建立9种细菌或真菌标准菌株的ICR小鼠血流感染模型,用蛋白液相芯片(Millipore)技术检测各实验组和PBS对照组感染后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h时血清中IFN-γ的浓度。结果 对照组小鼠血清IFN-γ的浓度极低。金黄色葡萄球菌组、粪肠球菌组和屎肠球菌组IFN-γ浓度均于细菌入血后12 h时达峰值。除铜绿假单胞菌外,革兰阴性菌均于感染后6 h时达峰值。白色念珠菌感染小鼠后24 h时IFN-γ的浓度达峰值。各实验组之间相比或各实验组与对照组相比,IFN-γ浓度差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IFN-γ在病原菌感染早期即升高,不同病原菌感染后达峰时间各不相同,革兰阴性菌感染后IFN-γ浓度升高最快且幅度最大,革兰阳性菌次之。IFN-γ在血流感染早期诊断和鉴别病原菌种类方面具有一定价值。