广西凡纳滨对虾源创伤弧菌耐药基因检测

该试验通过PCR方法检测27株广西凡纳滨对虾源创伤弧菌中耐药基因ant(3”)-I、aac(3)-II、sul1、tet(A)、tet(C)和TEM的携带情况。结果表明,27株创伤弧菌中,ant(3”)-I、aac(3)-II、sul1、tet(A)、tet(C)和TEM基因的检出率分别为0%(0/27)、0%(0/27)、55.6%(15/27)、70.4%(19/27)、81.5%(22/27)和51.9%(14/27);共包含7种耐药基因型,其中优势耐药基因型为ant(3”)-I^(-)aac(3)-II^(-)sul1^(+)tet(A)^(+)tet(C)^(+)TEM^(+)。

凡纳滨对虾小型温棚养殖模式水体微生物群落的研究

小型温棚养殖模式(下称小棚模式)是近年来凡纳滨对虾(LitopenaeuSvannamei)养殖的热点模式。为阐明小棚模式养殖水体微生物群落的特点,探究该模式高产、高效的原因,基于16SrRNA基因的测序结果,对第2、第44、第69和第96天小棚模式养殖水体的微生物群落组成和功能进行了分析。结果表明:凡纳滨对虾小棚养殖后期,水体微生物群落的丰富度和多样性显著高于前期;在整个养殖过程中,门水平主要优势菌为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门,其中变形菌门丰度在第69天显著增加,放线菌门丰度前期较高,后期下降;属水平优势菌属中Candidatus_Aquiluna的丰度在第2天最高(28.7%);海命菌属(Marivita)在中期富集,在第69天丰度最高(9.94%);黄杆菌属(Flavobacterium)的丰度随着养殖时间逐渐增加,在第96天达到最高(11.63%)。通过PICRUSt2预测微生物群落的功能,丰度前20的代谢功能项在第69和第96天的丰度显著高于第2天,尤其萜类和聚酮类代谢、脂类代谢、异种生物降解和代谢等功能均高度富集,通过FAPROTAX鉴定得出,化能异养类菌的丰度在养殖后期显著增加。环境因子关联分析发现,总氮(TN)和化学需氧量(COD)对小棚模式水体微生物群落结构的影响最大,海命菌属、Candidatus_Aquiluna、红小梨形菌属(Rhodopirellula)等微生物发挥了固碳、降氮、降磷的作用。综上所述,在高密度、高氮磷的环境条件下,小棚模式的水体微生物在保持水环境稳定和增强对虾免疫与抗病能力方面发挥了重要作用。

凡纳滨对虾TOR蛋白下游信号传导因子eIF4E2和eIF4E1A基因克隆与功能分析

为研究mTOR信号通路在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)氨基酸代谢中的调控作用,本研究利用RACE技术首次克隆获得了凡纳滨对虾肌肉组织中eif4e2和eif4e1a基因的全长c DNA序列。eif4e2基因c DNA序列全长1 069 bp,开放阅读框699 bp,编码232个氨基酸;eif4e1a基因c DNA序列全长3579bp,开放阅读框627bp,编码208个氨基酸。氨基酸序列比对和进化分析均证实eIF4E2和eIF4E1A为目前已知的eIF4E家族蛋白的同源蛋白。利用实时荧光定量PCR的方法研究了eif4e2和eif4e1a基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达差异以及注射雷帕霉素或氨基酸后肌肉中eif4e2和eif4e1a基因表达量的变化情况,探讨了eif4e2和eif4e1a基因在细胞生长中的调控作用。结果表明,凡纳滨对虾eif4e2和eif4e1a基因在眼柄、肝胰脏、肠道、胃、鳃丝和肌肉等组织中均有表达;其中eif4e2基因在肌肉中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),eif4e1a基因在肠道和肌肉中都有较高表达量,且在肠道中的表达量显著高于其在肌肉中的表达量(P<0.05);注射雷帕霉素后2 h内肌肉中eif4e2和eif4e1a基因表达量都出现显著下降(P<0.05);肌肉中eif4e1a基因的表达量在单独注射亮氨酸或精氨酸4 h内均未出现变化,但在同时注射亮氨酸和精氨酸后表达量显著增加(P<0.05);肌肉中eif4e2基因在注射亮氨酸、精氨酸及亮氨酸加精氨酸后表达量都明显提高(P<0.05),且同时注射亮氨酸和精氨酸后,基因表达变量明显比单独注射亮氨酸或精氨酸后变化量大。本研究从动物分子营养学角度出发,克隆了凡纳滨对虾mTOR信号通路中eif4e2和eif4e1a两个基因,并证明其能够通过mTOR信号通路接收不同氨基酸信号来调控细胞生长,对于深入了解对虾的生长和代谢调控机制、饲料配方的优化以及建立合理的养殖管理模式都具有重要的意义。

凡纳滨对虾碱性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表达及盐度应答效应

本研究通过c DNA末端快速扩增法(RACE)首次克隆得到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)基因的c DNA全长序列,其中ALP基因全长序列1 910 bp,编码536个氨基酸;ACP基因全长序列1 544 bp,编码439个氨基酸。盐度调控设3个盐度组:31(对照)、16和3。养殖45 d后,荧光定量PCR测定对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠和鳃5个组织中的ALP和ACP基因m RNA的表达情况。RT-PCR显示,ALP基因在5个组织中普遍表达,在肝胰腺中表达量最高(P<0.05),肠道中的表达量最低(P<0.05);ACP基因在5个组织中也均表达,在肝胰腺和鳃中表达量明显高于其他3个组织(P<0.05)。盐度应答实验表明,不同盐度条件下,不同组织中,ALP和ACP基因存在不同的表达模式。在胃和鳃组织中,ALP基因在31盐度组的表达量显著高于其他两组(P<0.05);在肝胰腺和肠道中,ALP基因在16盐度下的表达量明显低于其他两组(P<0.05);在肌肉中,ALP基因的表达与其他组织均不同,31盐度组表达量最高,而16盐度组最低(P<0.05);在肝胰腺中,ACP基因在31盐度组的表达量明显低于其他盐度组(P<0.05);在肌肉和鳃两个组织中,ACP基因在31盐度下的表达量明显高于其余两个盐度组(P<0.05);在肠道中,ACP基因的表达量在3盐度组明显高于其他两组(P<0.05);而在胃中,ACP基因在3个盐度下的表达量没有显著性差异。上述结果为研究低盐条件下凡纳滨对虾的磷酸酶基因的变化机制提供了参考。

凡纳滨对虾水孔蛋白-4的cDNA克隆及盐度胁迫对其肝胰腺mRNA表达水平的影响

为了探索水孔蛋白(Aquaporin,AQP)在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)渗透压调节过程中作用,本研究通过RACE方法获得克隆的凡纳滨对虾AQP(命名为LvAQP4)的c DNA全长序列,并分析了盐度胁迫对其肝胰腺m RNA表达的影响。结果发现:LvAQP4 c DNA序列全长为1 048 bp,其中包括75 bp的5￠UTR,187 bp的3￠UTR和786 bp的ORF。根据ORF序列推导出LvAQP4编码261个氨基酸,预测其分子质量为27.85 k Da,等电点为8.11。推导的氨基酸序列与其他甲壳物种的AQP相似度为48.8%到97.3%。进化分析显示LvAQP4属于AQP1-like亚族、AQP4类。定量PCR(q PCR)检测到LvAQP4在不同组织中均有表达,其中鳃的表达量最高,肝胰腺、肌肉、脑和眼柄中也较高,而血淋巴、肠、胃和胸神经节中表达量则较低。在高盐(盐度40)刺激下,凡纳滨对虾的肝胰腺LvAQP4 m RNA表达量会随着时间推移而上升,到6 h达到最高,而后逐步下降。而在低盐(盐度4)刺激下,凡纳滨对虾的肝胰腺LvAQP4 m RNA表达量并无明显变化。在原代分离和培养的肝胰腺细胞中,培养液中加入额外的Na Cl会剂量依赖地提高LvAQP4 m RNA表达水平。同样,通过在培养液中额外加入蔗糖提高培养液渗透压,也会剂量依赖地提高LvAQP4 m RNA表达水平,但作用不如Na Cl明显。这些结果表明盐度与肝胰腺LvAQP4的表达量有关,LvAQP4对凡纳滨对虾的渗透压调节具有非常重要的作用。

凡纳滨对虾设施养殖池塘浮游生物群落结构及多样性研究

研究了后期凡纳滨对虾设施养殖29个池塘中浮游生物的种类组成、数量差异及种类多样性。结果表明:共鉴定出浮游植物5门25属40种,浮游动物3门14属17种,未鉴定种类8种。其中硅藻门27种,绿藻门7种,蓝藻门4种,黄藻门1种,甲藻门1种;原生动物门8种,轮虫类6种,枝角类3种。29个池塘浮游植物丰度6.3×102~4.4×104cell/m L,生物量12.6~882.0 mg/L,Shannon-Wiener多样性指数0~3.17,Margalef丰富度指数范围0.56~0.95,Pielou均匀度0.19~0.90;浮游动物丰度12.6 mg/L^882.0 mg/m L,生物量1.2×102~2.7×102mg/L。凡纳滨对虾养殖池塘中,浮游生物种类相对自然海区少、密度大。在相同管理模式下,池塘中浮游生物种类和数量有较大差异,多样性指数也有较大差异。

凡纳滨对虾类Ig定性和定位的初步研究

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,运用Western-blotting和免疫组织化学等现代免疫学方法,对对虾中的类Ig(immunoglobulin,免疫球蛋白)蛋白进行定性和定位研究。结果发现,虾血清中有两种分子质量约为70 ku和62 ku的蛋白可与抗人Ig发生特异性的结合。同时,虾血细胞——无颗粒细胞的外膜及虾类淋巴器、肝胰脏、心脏、胃和肠等5种组织器官的石蜡切片与抗人Ig反应呈不同程度的阳性,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深。提示,虾体内确实存在能与抗人Ig发生特异性结合的类Ig蛋白,其不仅存在于虾血清中,还存在于无颗粒细胞、类淋巴器和肝胰脏等组织中,为对虾的免疫系统的研究和疾病的防治奠定基础。

海水和淡化养殖凡纳滨对虾的组织成分比较研究

对海水(盐度为28)和淡化(盐度为2)条件下养殖8周的凡纳滨对虾体营养成分蛋白质、脂肪、灰分、矿物质、氨基酸以及脂肪酸组成等进行了比较研究。2种盐度养殖的全虾粗蛋白与粗脂肪含量没有显著差异,但淡化养殖的全虾灰分含量显著降低。从2种盐度养殖的虾壳、肝胰腺、肌肉与血清等组织的矿物元素含量来看,淡化养殖对对虾的组织矿化程度造成一定的影响。淡化养殖的对虾血清蛋白含量下降,而肝胰腺指数却显著上升。2种盐度养殖的对虾肌肉氨基酸总量与脂肪酸总量没有显著差异,但淡化养殖的对虾肌肉必需氨基酸含量上升,而不饱和脂肪酸含量略微下降。结果表明,盐度对对虾各组织成分的影响是对虾对不同盐度的生境进行渗透调节与离子调控的适应性反应。

黄河盐碱地区南美白对虾淡化技术研究

为了促进陕西黄河盐碱地区南美白对虾养殖产业发展,该文采用单因子试验设计,分别对影响南美白对虾淡化效果的温度、养殖密度、免疫增强剂、淡化速度以及水源等因素进行了对比分析。结果表明:在适宜温度范围内,随温度上升南美白对虾淡化成活率逐渐上升,23℃以上有利于提高南美白对虾的淡化成活率;随淡化养殖密度增加,南美白对虾淡化成活率逐渐下降,密度超过150尾/L时,南美白对虾淡化成活率会显著下降(P<0.05);添加黄芪多糖、维生素C以及微生物制剂等免疫增强剂对南美白对虾淡化成活率影响差异不显著(P>0.05);淡化速度对比研究表明,采用较小的淡化速度,或随盐度下降逐步降低淡化速度的分阶段淡化模式可显著提高南美白对虾的淡化成活率(P<0.05),而黄河盐碱水源虽然在淡化前期成活率较高,但后期因pH较高导致氨氮等快速升高会造成南美白对虾淡化虾苗大量死亡。研究结果可为黄河盐碱地区南美白对虾淡化养殖条件优化提供参考依据。

凡纳滨对虾卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢不同发育时期的半定量和实时荧光定量PCR分析

卵黄蛋白原和血蓝蛋白是凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)卵巢和/或肝胰腺合成的重要蛋白。利用半定量和荧光定量PCR技术分别检测了亲虾卵巢不同发育期卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢和肝胰腺的相对表达量。结果显示,卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中均有表达,其相对表达量随着卵巢发育持续增加,在第五期达到最高,在恢复期迅速下降。根据卵巢和肝胰腺质量的综合计算,凡纳滨对虾的卵黄蛋白中,卵巢的贡献率占主导地位,约占80%,而肝胰腺仅为卵巢的四分之一。血蓝蛋白mRNA主要在肝胰腺中表达,随着卵巢的发育,表达量呈增加趋势,至第三期达到高峰,其后稍有下降,但仍然维持在较高水平,在第六期恢复到初始水平。血蓝蛋白是否直接或间接参与了卵黄发生和卵巢发育有待进一步探讨研究。

家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响

为研究饲料中添加家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响,在基础饲料中分别添加家蝇抗菌肽提取物0、1、2、3、4、5 g/kg,配制6种试验饲料.选取960尾健康、初始体均重为0.86（±0.01）g的凡纳滨对虾,分为6组,饲养8周后进行攻毒试验.结果显示,当抗菌肽提取物添加量为3 g/kg时,72 h内的累计死亡率与对照组相比显著降低.血细胞数量和吞噬率均以3 g/kg组最高,显著高于对照组、1、5g/kg组.当抗菌肽提取物添加量为2～3 g/kg时,对虾血清过氧化物酶（POD）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性和总抗氧化能力（T-AOC）均维持在一个较高的水平,且显著高于对照组;4 g/kg组超氧化物歧化酶（SOD）活性与对照组相比显著升高,肝胰腺AKP活性、T-AOC水平均以4 g/kg组最高,显著高于对照组;3g/kg组LZM活性显著高于对照组、1、4、5 g/kg组.结果表明,饲料中添加适量的家蝇抗菌肽可以提高凡纳滨对虾的免疫力和抗白斑综合征病毒的能力.

IHHNV编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活研究

应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。

基于DBN-LSSVR的南美白对虾养殖溶解氧预测

为了提高南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖溶解氧预测的精度,提出了深度信念网络融合最小二乘支持向量回归机(Deep belief nets-least squares support vector regression,DBN-LSSVR)的南美白对虾养殖溶解氧预测模型.首先,采用深度信念网络(Deep belief nets,DBN)方法,多尺度提取养殖水质时序数据的特征向量;然后,使用提取的养殖水质特征向量训练和优化DBN-LSSVR,构建了基于DBN-LSSVR的对虾养殖水质溶解氧预测模型;最后,以广州市番禺区南美白对虾养殖水质溶解氧实测数据为基础,对预测模型进行了实验验证,并与浅层BP神经网络、标准最小二乘支持向量回归机进行了对比分析.所构建的模型具有较高的预测精度和泛化性能,是一种有效的南美白对虾养殖溶解氧预测方法.