基于ICP-MS技术的六神曲中无机元素分析及其风险评估

对六神曲中无机元素进行分析并结合风险评估,为发酵类中药中有益元素的揭示、有害元素限量标准的制定提供依据。基于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术,对不同来源六神曲中无机元素进行含量测定,结合多元统计分析,对无机元素的特征进行表征,并对其进行初步风险评估。结果表明:六神曲中无机元素整体趋势一致,对比相关标准产六神曲生品发现,Zn、Ba、Cu为主要差异元素;按部颁标准产六神曲生品与麸炒品差异明显,Zn、Tl、Cu为特征差异元素;Cu、Cr、As为按《浙江省中药炮制规范》产六神曲生品与炒焦品中主要差异元素。风险评估结果提示,六神曲中有害元素的风险较低。方法稳定可靠,不同制法、不同炮制品六神曲中元素分布特征呈现出一定的规律性与差异性,其中重金属及有害元素的风险基本可控。研究结果可为六神曲质量控制体系的完善及安全性评价提供参考。

基于物联网技术的六神曲生产全流程追溯监管体系构建

目的:构建基于物联网技术的六神曲生产全流程追溯监管体系。方法:梳理物联网技术在中药材种植生产环节、中药监管模式上的应用,对“浙产名药”六神曲种植生产追溯体系进行分析,构建六神曲种植生产监管模式。结果:以物联技术为核心、数据联通为主线、矩阵赋码为载体、流程可视为关键、“人机料法环”数字化呈现为重点,可实现六神曲种植生产全流程可追溯可监管。结论:在追溯过程中融入信息技术,有利于提高监督管理的质量与效率,从饮片质量管理层面保障了广大患者用药的安全性与有效性,建立基于物联网技术的新型监管模式、规范中药产业市场秩序具有重要的研究价值与现实意义。

UPLC-MS/MS法快速测定六神曲中的7种真菌毒素

目的建立快速测定六神曲中7种真菌毒素残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。方法色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),流动相为乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol·L^(-1)甲酸氨溶液,梯度洗脱,流速为0.4 mL·min^(-1),柱温为30℃。采用电喷雾离子源,正离子模式,工作模式为多反应监测模式。结果该方法专属性好,7种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数r在0.9987~0.9995之间,平均回收率为84.7%~108.0%,RSD为2.8%~5.8%(n=6)。实际样测定中,10批样品中共有2批检出黄曲霉毒素B1,含量分别为1.24,2.35μg·kg^(-1),其余毒素均未检出。结论该方法快速、简便、回收率高,适用于六神曲中真菌毒素的质量监测。

六神曲两步法发酵微生物群落结构及功能分析

六神曲可健胃消食,发酵方式分为一步法和两步法,该研究采用基于扩增子的高通量测序技术对六神曲两步法发酵过程及部分原料缺失时的微生物群落结构进行分析,并基于基因测序结果进行功能预测。结果表明,六神曲发酵过程中pH逐渐下降,微生物群落多样性显著降低,在发酵后期细菌以乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)为主,真菌以毛孢子菌属(Trichosporon)为主;功能预测结果表明,六神曲发酵期间次级代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成和碳代谢等相关基因有明显变化;发酵原料缺少青蒿、辣蓼、苍耳草或苦杏仁任何一种,细菌多样性均降低,而真菌多样性增加,其中乳杆菌属和毛孢子菌属的丰度均明显降低,片球菌属为优势菌。

市售六神曲质量研究

目的建立同时测定六神曲中4种主要成分含量的HPLC方法。方法采用YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5μm)的色谱柱,流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)溶液,梯度洗脱,二极管阵列检测器(DAD)全波长检测,检测波长280 nm,柱温30℃,流速1 mL·min-1,进样体积10μL。结果没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、槲皮素浓度分别在14.9~298μg·mL-1、12.8~256μg·mL-1、13.9~278μg·mL-1、14.3~286μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率分别为101.5%、99.0%、97.8%、96.2%。结论所建立的六神曲中4种成分含量测定法简单易行,可为六神曲中药材质量控制提供科学依据。

高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定六神曲中青蒿素的含量

目的建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法测定六神曲中的青蒿素的含量。方法采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.2%乙酸(62∶38)为流动相进行洗脱,流速1.0 m L·min^(-1),柱温25℃;蒸发光散射检测器漂移管温度50℃,载气压力30 psi,增益值为50;进样量10μL。结果青蒿素在0.5~10.0μg线性关系良好,R2=0.9992。方法回收率为96.7%,RSD=3.8%(n=6)。结论本法具有良好的精密度和重现性,结果准确可靠,可作为六神曲饮片的质量控制方法,为生产提供依据。

不同产地六神曲对实验动物肠管运动功能的影响

目的观察不同产地六神曲对实验动物肠运动功能的作用。方法取用四川、安徽和河南三个产地的六神曲,采用离体方法研究不同产地六神曲对大鼠回肠平滑肌收缩活动的影响以及阿托品对其作用的影响;采用整体方法研究不同产地六神曲对地芬诺酯导致胃肠动力障碍小鼠肠内容物推进的影响。结果离体实验结果表明,三个产地六神曲都能引起大鼠肠平滑肌的收缩作用增强(分别为P<0.001,P<0.01,P<0.05),且该作用受阿托品影响;小鼠肠推进实验结果表明,与模型组比较,四川和安徽二个产地六神曲组对胃肠动力障碍小鼠肠内容物推进作用明显(P<0.01,P<0.05),河南产地六神曲作用不明显(P>0.05)。结论六神曲可增强大鼠离体回肠平滑肌的收缩和小鼠小肠推进作用,但不同产地六神曲的作用效应有所不同,受产地的影响。

六神曲配方颗粒的制备工艺研究

目的:以生物活性为指标,研究六神曲配方颗粒的制备工艺。方法:采用正交试验,以淀粉酶活性和出膏率为指标,考察提取工艺参数;以淀粉酶活性为指标,考察浓缩工艺;以干膏粉淀粉酶活性和含水量为指标,考察喷雾干燥工艺;以颗粒的性状和得率为指标,考察干法制粒工艺。结果:六神曲配方颗粒的最佳制备工艺为六神曲饮片40℃水浴提取3次,每次1h,加10倍量饮用水;50℃减压浓缩至相对密度1.08(50℃),经喷雾干燥制成干膏粉,加适量辅料混匀后进行干法制粒制成颗粒。结论:通过3批验证工艺,验证所得颗粒淀粉酶活性为55.37U(RSD=3.85%,n=3),表明该工艺稳定可行。

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定六神曲中的米酵菌酸

基于超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS),建立了快速测定六神曲中生物毒素米酵菌酸残留的检测方法。样品首先以甲醇作为提取溶剂进行超声提取,再用氨水调节pH值至8,过滤,滤液用Oasis MAX强阴离子交换固相萃取柱处理。采用Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μ m)分离,以乙腈-含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmoL/L 甲酸铵溶液为流动相,采用电喷雾电离(ESI)源电离,电离模式为负离子模式,质谱检测模式为多反应监测(MRM)模式。在最佳条件下,米酵菌酸在0.5~100 μ g/L 范围内呈良好的线性关系,相关系数( R 2)>0.99。方法的加标回收率为80.6%~85.3%,日内和日间精密度分别为4.2%~6.8%和8.2%~13.2%。方法的检出限(LOD, S/N =3)和定量限(LOQ, S/N =10)分别为0.4 μ g/kg 和1.2 μ g/kg 。实际样品测定中发现了六神曲中存在米酵菌酸残留的现象,为保健食品和中药材中生物毒素的风险监控提供了重要的科技支撑。该方法简单、快速、灵敏度高,适用于六神曲中生物毒素米酵菌酸残留量的测定。

六神曲发酵辨析

我国自春秋时期就开启了用发酵法制作中药的历史。发酵有降解原料中低活性成分,产生高活性成分的作用。六神曲是代表性发酵中药,厘清其发酵本质,对发展传统发酵方法,提高中药活性极具研究价值。文章依据六神曲的起源、发展,通过对比六神曲与其起源——酒曲的制作工艺、发酵原料、发酵微生物、功能生物酶,辨析了六神曲的发酵本质。认为六神曲原料中的辣蓼、青蒿、苍耳草在发酵过程中有调节微生物体系的作用,发酵过程的有益菌能降解淀粉、蛋白质、脂肪酸,产生乙醇、高级醇及酯物质的霉菌、酵母菌、细菌。深入分析这些菌中与六神曲成分产生有关的功能性生物酶,对揭示六神曲的发酵机制至关重要。通过分析六神曲与酒曲的成分与药效活性差异,考察发酵过程中微生物对成分转变的影响,研究原料组成与微生物酶活性的关系,探索成分与肠道菌群结构及代谢产物的相关性,可以深入揭示六神曲发酵过程中成分转化机制及其健脾作用机制,从而为六神曲的质量控制与工艺研究提供依据。

六神曲中总有机酸含量的测定

为了对六神曲质量进行有效评价,收集了陕西省六神曲主要生产厂家不同月份生产的24批样品,采用电位滴定法,建立了六神曲总有机酸含量测定方法,滴定至pH 8.2为终点。结果表明,该方法重现性、稳定性好,回收率在97.37%~100.88%;总有机酸含量在0.69%~2.05%,说明此方法可用于六神曲的质量控制,为有效控制质量、提升质量标准提供了科学依据。

基于仿生感官技术对不同产地六神曲的质量评价

目的:基于仿生感官技术分析不同产地六神曲性状,比较不同产地六神曲质量。方法:采用电子舌、电子鼻、分光测色计对24批次六神曲粉末味、气、色数据进行主成分分析(PCA),从中提取特征指标,后对整体感官特征指标做PCA、聚类分析。结果:以前2个主成分对滋味建模,累积贡献90.86%,PC1特征值较大的是PKS(通用)、NMS(鲜)、ANS(甜)、CPS(通用)、CTS(咸),PC2特征值最大的是SCS(苦);对气味响应明显的是W1W(无机硫)和W2W(有机硫),以前2个主成分建模,累积贡献99.92%。色度系统变异系数a*>b*>L*。以ANS、CTS、NMS、W1W、W2W、a*、b*指标分析六神曲整体性状,提取前3个主成分,分别定义为滋味因子、甜味因子和气色因子,累积贡献91.27%。欧氏距离=24时,样品划分为1、2两类,欧氏距离=20时,可划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类。结论:仿生感官技术与PCA和聚类分析相结合可为六神曲质量评价提供参考。

六神曲生品与炒制品的消化酶活力及胃肠动力比较

目的比较六神曲生品和炒制品在消化酶活力和促进胃肠动力方面的差异,为临床合理应用六神曲提供实验依据。方法淀粉酶活力应用碘量法测定,蛋白酶活力应用福林-酚试剂比色法测定;采用小鼠小肠推进实验方法评价六神曲生品和炒制品对胃肠蠕动的影响。结果六神曲生品的淀粉酶活力为(164.49±5.11)U·g^(-1),炒制后活力明显下降(P<0.01),为(19.86±0.65)U·g^(-1);六神曲生品的蛋白酶活力为(15.37±1.92)U·g^(-1),炒制后活力增强(P<0.01),为(22.74±0.96)U·g。。;六神曲生品和炒制品均能改善病理模型小鼠小肠的推进功能(P<0.05),且生品优于炒制品(P<0.05)。结论六神曲生品和炒制品均含有淀粉酶、蛋白酶成分和促进胃肠动力效应;六神曲生品中淀粉酶活力较高,而炒制后蛋白酶活力明显增高,临床可依据消化不良类型而分别合理使用。

六神曲的发酵菌种分离及纯种发酵考察

目的:筛选优势菌种,探索纯种发酵对六神曲发酵炮制品质量的影响。方法:采用微生物菌种分离方法,从实验室自制和同仁堂购买的六神曲中筛选菌种,采用部分霉菌进行六神曲纯种发酵后淀粉酶及蛋白酶活力测定。淀粉酶活力测定依据碘-淀粉比色法,蛋白酶活力测定采用Folin试剂法。结果:筛选出12株霉菌,黄曲霉能显著提高六神曲淀粉酶和蛋白酶的活力,自制六神曲中分离的杂色曲霉产蛋白酶活力最高,其次为同仁堂分离的肉色曲霉和伞枝犁头霉,其余各组产蛋白酶活力明显低于传统自然发酵组。结论:六神曲原材料中不含淀粉酶、蛋白酶,纯种发酵能稳定提高六神曲发酵炮制品的质量。

基于衍生化-HPLC测定酶解葡萄糖的方法评价六神曲中糖化酶活力

目的:建立柱前衍生化的高效液相色谱法测定不同厂家六神曲中葡萄糖含量,通过葡萄糖含量计算糖化酶活力,评价市售六神曲质量。方法:样品以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生化试剂,进行柱前衍生化。采用C;色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈为流动相A,0.05 mol·L^(-1)磷酸盐缓冲液(pH 6.8)为流动相B,梯度洗脱,柱温30℃,检测波长为250 nm。结果:葡萄糖进样量线性方程相关系数为0.9994;平均回收率(n=6)为100.6%,RSD小于3.0%。不同生产厂家的六神曲糖化酶活力为4.51~290.27 U·μmol^(-1),差异较大。结论:该方法可用于六神曲中酶解葡萄糖含量的测定,评价糖化酶活力及为后续六神曲质量控制及等级评价提供数据支持和理论依据。

六神曲两菌协同发酵工艺的优化

目的:优化两菌协同发酵工艺,提高六神曲消化酶活力。方法:利用酵母属真菌扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsisfibuligera)和细菌枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilis subsp.subtilis)协同发酵六神曲,在2008年版《北京市中药饮片炮制规范》方法二基础上,以蛋白酶活力和淀粉酶活力为指标对发酵工艺进行单因素考察并进行Box-Behnken响应面设计,寻找最优发酵工艺。结果:最优发酵工艺为枯草芽孢杆菌和扣囊复膜酵母菌按4:1的比例接种,总接种量为40%,发酵5d。9批自制神曲的蛋白酶活力和淀粉酶活力的RSD分别为4.35%和4.73%,蛋白酶活力远高于北京市炮制规范下生产的传统发酵商品神曲(P<0.01)。结论:两菌协同发酵自制神曲可以提高酶活力稳定性及蛋白酶活力。