基于网络药理学和分子对接探讨六味地黄丸异病同治老年性聋和阿尔茨海默病的作用机制

目的借助网络药理学和分子对接的方法探讨六味地黄丸异病同治老年性聋和阿尔茨海默病(AD)的共同分子机制,并采用细胞实验进行验证。方法利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、成分靶点数据库(SwissADME)获取六味地黄丸有效成分,并结合基因和化学物质相互作用预测数据库(STITCH)获取作用靶点。利用人类基因综合数据库(Genecard)、人类疾病相关基因与突变位点信息数据库(DisGeNET)获取老年性聋和AD靶点。使用Cytoscape 3.7.1软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络,借助蛋白互作网络分析数据库(STRING)构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,获取核心靶点。利用富集分析数据平台(Metascape)对共有靶点进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。采用AutoDock Vina 1.1.2软件对核心靶点与相关成分进行分子对接。采用过氧化氢(H2O2)致PC12细胞氧化损伤模型,观察六味地黄丸的作用。采用细胞计数(CCK-8)法观察细胞存活率,活性氧(ROS)检测试剂盒检测ROS水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平,Western blot法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化-蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达。结果共获得六味地黄丸有效成分86种,主要来自薯蓣皂素、视黄醇、丹皮酚、软脂酸等化合物,六味地黄丸防治老年性聋和AD共有靶点49个,核心靶点为AKT1、TNF、IL-6、MMP-9等。GO分析表明这些共有靶点主要参与对氧化应激的反应、对脂多糖的反应等生物进程。KEGG通路分析显示,共有靶点主要涉及缺氧诱导因子-1(HIF-1)、核因子-κB(NF-κB)等信号通路。分子对接结果显示,TNF-α、IL-6、AKT1、MMP-9与相关成分均存在结合可能。细胞实验结果发现,六味地黄丸含药血清可以增强细胞存活率,降低细胞ROS、TNF-α、IL-6水平,增加MMP-9蛋白表达水平,降低p-AKT蛋白表达水平。结论六味地黄丸异病同治老年性聋和AD具有物质基础,其共同的分子机制,可能是通过薯蓣皂素、视黄醇、丹皮酚等多种成分,作用于AKT、TNF-α、IL-6、MMP-9等核心靶点,抑制炎症反应和氧化应激,减少神经元死亡。

养阴清热化痰方合六味地黄汤治疗慢性阻塞性肺疾病肺肾阴虚证的疗效观察

目的探究养阴清热化痰方合六味地黄汤治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺肾阴虚证疗效。方法选取本院于2022年1月~2022年12月收治的126例COPD患者。采用随机数字表法将患者分为接受常规治疗的对照组(63例)与接受养阴清热化痰方合六味地黄汤治疗的观察组(63例)。比较两组疗效、症候积分以及血清指标。结果治疗后观察组有效率高于对照组,中医症候积分、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平显著低于对照组(P<0.05)。结论针对COPD采用养阴清热化痰方合六味地黄汤疗效确切,对COPD患者症状以及炎症因子水平具有显著改善作用,值得临床推广。

六味地黄方及配伍对去势雌性大鼠动脉粥样硬化模型的作用

目的探讨六味地黄方（熟地黄,山药,泽泻等）及其配伍对更年期动脉粥样硬化模型大鼠的影响。方法用健康雌性大鼠,假手术组切除双侧卵巢下方少量脂肪,其余动物切除双侧卵巢,以高脂饲料喂养并灌胃给予维生素D3复制大鼠更年期动脉粥样硬化模型。30 d后,将总胆固醇〉5-10 mmol/L的大鼠随机分为6组：模型组、苯甲酸雌二醇组、六味地黄方组、熟地/泽泻组、山茱萸/丹皮组、山药/茯苓组,灌胃给药。油红染色检测血管病变程度,放免法检测血中6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF（1α））、血栓烷素B2（TXB2）、炎性相关因子C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）水平,免疫组化和Western blot法检测大鼠主动脉雌激素膜受体GPR30的表达。结果六味地黄方及其配伍能够不同程度地减轻模型大鼠血管病变,改善血中6-keto-PGF（1α）和TXB2平衡,降低血中炎性因子表达,升高主动脉雌激素膜受体GPR30表达。结论六味地黄方具有治疗更年期动脉粥样硬化的作用,各药对相互配伍协同阻止动脉粥样硬化的形成。

固相萃取HPLC法研究六昧地黄方中马钱素和莫罗苷的血药浓度及配伍变化

目的建立测定六味地黄方中有效成分马钱素(loganin)和莫罗苷(morroniside)大鼠血清浓度的固相萃取HPLC法;研究大鼠灌胃给予六味地黄方后血清中马钱素和莫罗苷的浓度变化。方法血清样品经C_(18)固相萃取柱提取后,采用HPLC法测定给药前后大鼠药物血清中马钱素和莫罗苷的浓度,并对该方法进行方法学考察。结果血清中内源性物质不干扰样品中马钱素和莫罗苷的测定,马钱素和莫罗苷的线性关系良好,相关系数分别为0.999 8,0.999 8,方法回收率在95%～105%,提取回收率均大于75%,日内精密度和日间精密度均小于12%。结论该方法具有灵敏、快速的优点,可满足不同配伍六味地黄方有效成分在大鼠体内药代动力学研究的要求。不同配伍对药物血清中有效成分的吸收有一定影响。

膜分离技术与传统工艺对六味地黄活性多糖富集效果的比较

目的:比较分析膜分离技术与传统工艺对六味地黄多糖活性成分的富集效果。方法:采用纳滤膜和10万分子量的超滤膜对两种工艺制得的六味地黄方药液进行分段富集,建立硫酸-蒽酮法测定各分段溶液的含糖量。结果:采用膜分离技术制成的滴心丸中活性多糖含量为经传统工艺制得的胶囊的6.5倍。结论:在富集六味地黄活性多糖方面,膜过滤工艺较传统工艺具有较大的优势。

六味地黄方通过上调肠道雌激素受体改善绝经后ApoE^-/-小鼠脂代谢异常研究

目的应用双侧卵巢去势的ApoE^-/-小鼠建立绝经后脂代谢异常模型,探究六味地黄方(LW)能否通过调节肠道雌激素受体改善绝经后脂代谢异常。方法正常饮食的C57/B6小鼠为对照组(n=6),高脂饮食并接受假手术的ApoE^-/-小鼠为假手术对照组(n=6),高脂饮食并接受双侧卵巢去势的的ApoE^-/-小鼠为模型组(n=6),模型小鼠接受4.5 g/kg(n=6)或9.0 g/kg(n=6)的六味地黄方治疗90 d。生化法检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酸酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)及高密度脂蛋白(HDL-C)水平,HE染色检测小鼠肝脏脂质损伤,油红染色检测小鼠肝脏脂质堆积,免疫荧光染色检测小鼠空肠雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、ABCG5、ABCG8、PI3K p110β及p-AKT的表达水平,免疫化学染色检测小鼠空肠NPC1L1的表达水平,Western blot法检测小鼠空肠NPC1L1、ABCG5及ABCG8的表达水平。结果六味地黄方可降低模型小鼠血清TC、TG及LDL-C水平,升高HDL-C水平(P<0.05~0.01);同时,六味地黄方可显著降低模型小鼠的肝脏脂质损伤和脂肪堆积(P<0.05~0.01)。六味地黄方显著增加模型小鼠空肠内降低的ERα和ERβ水平(P<0.05~0.01)。六味地黄方显著降低模型小鼠空肠中NPC1L1的表达水平(P<0.05),并上调ABCG5和ABCG8的表达水平(P<0.01)。六味地黄方显著增加模型小鼠空肠内PI3K p110β及p-AKT的表达水平(P<0.05~0.01)。结论六味地黄方可以显著改善绝经后ApoE^-/-小鼠脂代谢异常,其机制与六味地黄方调节肠道胆固醇的吸收和外排有关。上调肠道雌激素受体表达和肠道PI3K/AKT信号可能是六味地黄方调节肠道胆固醇吸收和外排的机制。

人参固本口服液治疗放化疗骨髓抑制机制探讨

骨髓抑制是恶性肿瘤放化疗中的常见不良反应之一。中医药在治疗放化疗所致的骨髓抑制中具有效果明确、不良反应小的优点。人参固本口服液由千古名方六味地黄丸与人参固本丸合方而成,是治疗放化疗骨髓抑制的有效药物。现从人参固本口服液的组方结构、功效特点和现代药理研究探究其治疗放化疗骨髓抑制的机制,以期为人参固本口服液在放化疗骨髓抑制防治中的应用提供理论指导。

基于FOXO1的抗氧化作用探讨六味地黄方对去卵巢大鼠及H_(2)O_(2)诱导的氧化损伤MC3T3⁃E1细胞的干预作用

目的观察六味地黄方对去卵巢(OVX)大鼠氧化应激相关指标、骨转换标志物及股骨叉头框蛋白O1(FOXO1)表达的干预作用,并探讨其能否通过FOXO1来发挥抗氧化作用及其作用机制。方法(1)动物实验。将雌性Wistar大鼠分为正常组、假手术组、模型组、补佳乐组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、六味地黄方大剂量及小剂量组,药物干预8周后检测骨髓活性氧(ROS)、血清抗氧化指标[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)]、骨转换标志物[骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OCN)、血清I型胶原羧基末端肽(CTX-I)]及股骨FOXO1蛋白表达。(2)细胞实验。制备对照组含药血清和低、中、高剂量含药血清。①将胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)分为正常组、模型组、对照含药血清组,以及低、中、高剂量含药血清组和NAC组,检测各组细胞FOXO1蛋白表达。②沉默MC3T3-E1细胞的FOXO1基因表达,以Western blot法验证后,将细胞分为正常组、模型组、NAC组、高剂量含药血清组、siNC组、siFOXO1组、siFOXO1+高剂量含药血清组,检测各组细胞的增殖及ROS水平。③将MC3T3-E1细胞分为正常组、模型组、NAC组、对照含药血清组,以及高剂量含药血清组,检测各组细胞p-FOXO1蛋白表达。结果(1)动物实验:与假手术组比较,模型组SOD、CAT、GSH-PX、GSH、BALP、OCN水平均明显降低(P<0.05),CTX-I、ROS水平及FOXO1蛋白表达均明显升高(P<0.05);与模型组比较,六味地黄方大剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH、BALP、OCN水平均明显升高(P<0.05),CTX-I、ROS水平及FOXO1蛋白表达均明显降低(P<0.05)。(2)细胞实验:①与正常组比较,经H_(2)O_(2)处理的MC3T3-E1细胞FOXO1蛋白表达明显增加(P<0.05);含药血清各剂量组FOXO1蛋白表达均低于模型组(P<0.05);②沉默MC3T3-E1细胞FOXO1基因后,siFOXO1组在48 h及72 h细胞增殖均明显低于模型组和siNC组(P<0.05),ROS水平明显高于模型组和siNC组(P<0.05);siFOXO1+高剂量含药血清组在各时间点细胞增殖均明显高于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但都明显低于高剂量含药血清组(P<0.05);ROS水平明显低于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但明显高于高剂量含药血清组(P<0.05);③通过检测p-FOXO1发现,模型组p-FOXO1/GAPDH明显低于正常组(P<0.05);高剂量含药血清组p-FOXO1/GAPDH明显高于模型组(P<0.05)。结论六味地黄方能抑制OVX大鼠骨髓ROS水平,提高血清抗氧化水平,促进OVX大鼠骨形成,抑制骨吸收,其机制可能部分与促进成骨细胞FOXO1磷酸化有关。

六味地黄方通过调节肠道菌群和胆汁酸代谢改善绝经后APOE^(-/-)小鼠的胆固醇代谢异常

目的探究六味地黄方调节肠道菌群和胆汁酸代谢改善小鼠绝经后胆固醇代谢异常及可能的作用机制。方法利用双侧卵巢摘除的APOE^(-/-)小鼠给予高脂饮食,复制绝经后胆固醇代谢异常模型,并给予0.13 mg·kg^(-1)的雌二醇和9.0 g·kg^(-1)的六味地黄方进行治疗。90 d治疗结束后,生化法检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和肝脏、粪便中TC水平;ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)水平;肝脏HE和油红O染色观察小鼠肝脏脂质损伤;生化法检测小鼠肝脏、血清、胆囊和粪便中总胆汁酸(TBA)含量;液相质谱联用技术(UPLC-MS)对小鼠肝脏和粪便胆汁酸组分定量分析;16S rRNA测序分析小鼠结肠菌群,并分析粪便胆汁酸组分和肠道菌群之间的相关性。结果六味地黄方可以降低模型小鼠血清TC、TG、LDL-c以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.01),提高HDL-c水平(P<0.01);并减少肝脏脂质堆积,减轻肝脏损伤;还可降低血清、胆囊和肝脏TBA水平(P<0.01),增加粪便中TBA排出(P<0.01);减少粪便TαMCA、TβMCA、TCA、TCDCA、TDCA和CA结合型胆汁酸的含量(P<0.05,P<0.01),增加次级胆汁酸LCA的含量(P<0.01)。六味地黄方恢复了模型小鼠结肠菌群的平衡,上调粪异杆菌属(Allobaculum)的相对丰度(P<0.01),并下调颤螺菌属(Oscillospira)和普氏菌(Prevotella)的相对丰度(P<0.05)。结论六味地黄方通过重塑结肠菌群的结构恢复菌群的平衡,增加粪便中次级胆汁酸的排出以降低血清和肝脏中胆固醇沉积,从而改善模型小鼠胆固醇代谢异常。

基于转录组数据分析的六味地黄方活性组分LWD-b抗补体作用的发现与验证

目的 基于转录组数据分析发现与验证六味地黄方活性组分的抗补体作用,并研究其可能的作用途径。方法 人恶性黑素瘤细胞A375用DMEM/F12高糖培养基培养,分为细胞对照、六味地黄苷糖LW-AFC、寡糖组分CA-30、多糖组分LWB-B和糖苷组分LWD-b组(终浓度均为100 mg·L^(-1)),培养6 h后用L1000技术采集细胞转录组数据,采用Cosine相似度算法和特征方向法对各组转录组数据进行相似性比对和差异表达分析,采用基因富集分析算法进行KEGG通路富集分析。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定补体通路基因C3和C5 m RNA表达。采用基于补体经典途径的溶血活性实验测定相对溶血率,观察LWAFC,CA-30,LWB-B和LWD-b(终浓度均为1,10和100 mg·L^(-1))及LWD-b中各主要成分莫诺苷、芍药苷、獐牙菜苷、马钱苷、马钱苷酸和丹皮酚原苷(终浓度均为1和100μmol·L^(-1))的抗补体活性。采用补体成分(C1q,C2,C3,C4,C5和C9)缺失血清法测定LWD-b的补体作用靶点。结果 转录组数据分析结果显示,LWD-b下调的基因显著富集于补体级联激活通路(P<0.01),而LW-AFC,CA-30和LWB-B此作用不明显。RT-qPCR结果表明,与细胞对照组相比,LWD-b 100 mg·L^(-1)组补体C3和C5 mRNA表达明显降低(P<0.01)。抗补体活性测定结果表明,与补体组相比,LWD-b各浓度组及LW-AFC 10和100 mg·L^(-1)组相对溶血率均明显降低(P<0.01),但仅LWD-b组相对溶血抑制率>20%,提示LWD-b具有抗补体活性,LW-AFC,CA-30和LWB-B此作用不明显。LWD-b中主要成分的抗补体活性筛选结果表明,与补体组相比,莫诺苷1和100μmol·L^(-1)组及芍药苷100μmol·L^(-1)组相对溶血率均明显降低(P<0.01),且相对溶血抑制率均>20%;獐牙菜苷、马钱苷、马钱苷酸和丹皮酚原苷组相对溶血率虽也明显降低(P<0.01),但其相对溶血抑制率均<20%;提示莫诺苷和芍药苷具有显著抗补体活性,而其余成分抗补体活性较弱。补体成分缺失血清法测定结果表明,分别与补体C1q,C2,C3,C5和C9缺失血清组相比,LWD-b 100 mg·L^(-1)处理后相对溶血率变化均<5%,提示LWD-b降低溶血能力与其作用于上述补体成分相关。结论 基于转录组数据分析发现并验证了六味地黄方活性组分LWD-b具有抗补体激活作用,莫诺苷和芍药苷可能是其发挥该作用的主要活性成分。LWD-b可能通过作用于补体成分C1q,C2,C3,C5和C9发挥作用。

经典名方“六味地黄丸”及其加减方相关专利分析

本文旨在对经典名方六味地黄丸及其相关专利进行分析,以其探讨六味地黄丸在知识产权保护方面的现状,并以此为鉴,研究其他经典名方知识产权保护现状。通过较为准确的关键词,充分使用追踪检索、块检索、转库检索等检索策略,结合算符命令等获得检索结果利用S系统的统计命令和Excel、incopat等辅助软件对该领域的专利申请数据进行统计分析。将六味地黄丸作为基础方,在其基础上配伍其他药物进行组方仍然是专利申请的重点方向,这与中药领域整体申请方向一致。

膜分离技术富集六味地黄糖类成分工艺研究

目的:研究用膜分离技术富集六味地黄糖类成分的工艺。方法:采用正交试验法,以总糖含量为评价指标,以温度、压力、药液浓度为考察因素优选最佳制备工艺。结果:最佳工艺为压力0.5MPa、温度45℃,药液浓度的影响微小。采用膜分离技术富集后,六味地黄提取物收率由20%降低至16%左右,总糖含量由40%提高到60%以上。结论:该工艺操作方便、实用可行,能有效富集多糖等活性成分。