A NEW METHOD OF ISOLATING KUPFFER CELLS FROM BIOPSY TISSUE OF RAT LIVER

The isolation of a high yield and purity of Kupffer cells has been reported in detail.1 This paper reports into the research about isolation Kupffer cells from biopsy tissue of liver. This method includes 5 important steps: (1) take fresh liver tissue, and mince with scissors. (2) spin at low speed to wash off red blood cells. (3) digest in collagenase for suitable time. (4) isolate Kupffer cells on a percoll density gradient. (5) cell charaterization was observed by N.S.E stain and peroxidatic activity with lumino-meter measurement and phagocytosis with latex beads.2.3

Simplified methods to isolate,culture and purify olfactory ensheathing cells

Conventional methods for harvesting, culturing and purifying olfactory ensheathing cells are complicated, time-consuming, and poorly reproducible. Olfactory bulbs were detached from adult Sprague Dawley rats and olfactory ensheathing cells were isolated using shearing, dispersion processes. After the primary cultures reached confluence, the cells were purified using a three-step process. The olfactory ensheathing cells attached and grew rapidly. The purity of the olfactory ensheathing cells increased following the three purification steps, eventually exceeding 95%. These cells could be maintained for an extended period time in culture. This simple, inexpensive, reproducible method of harvesting, culturing and purifying olfactory ensheathing cells shortens the culture cycle and provides sufficient olfactory ensheathing cells of controllable purity.

一种小鼠原代肝细胞的分离与培养方法

目的:探索一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离方法,并延长其体外培养的时间。方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以含双抗的D-Hanks灌流液经肝门静脉充分灌注肝脏,然后以0.2 mg/mL的Ⅳ型胶原酶灌注消化,接着过滤、离心、洗涤,获得小鼠原代肝细胞。通过台盼蓝染色检验小鼠原代肝细胞活率,利用倒置显微镜观察肝细胞的形态变化,糖原染色鉴定细胞纯度,添加ITS-X和HGF细胞因子延长小鼠原代肝细胞的体外培养时间。结果:平均每只成年小鼠肝脏可提取获得原代肝细胞约2×107个,台盼蓝染色显示细胞活率均超过95%,糖原染色结果表明此方法获得的原代肝细胞纯度高于95%,通过添加HGF和ITS-X两种细胞因子能够有效地延长肝细胞形态的体外维持时间。结论:本实验在原有小鼠原代肝细胞两步灌流分离法和培养的基础上,经过优化,成功建立了一种高效、稳定的小鼠原代肝细胞分离和培养方法,为肝脏的体外研究提供了技术保障。

差异过筛法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的:采用差异过筛法培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)。方法:取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、细胞筛网过滤、收集网下滤过物、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO_(2)培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、血管性血友病因子(vWF)免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果:培养24 h后血管段周围爬出短梭形的细胞;48 h后岛屿状的细胞集落形成;72 h后细胞铺满瓶底,呈典型的单层、铺路石样、镶嵌式贴壁生长;免疫细胞化学染色显示,所培养细胞的细胞质呈现棕红色,vWF表达为阳性。结论:差异过筛法能够成功分离培养出原代大鼠BMECs。

原代培养大鼠肝细胞分离方法比较研究

目的:探索原代培养大鼠肝细胞的最佳分离方法。方法:对比观察不同的肝细胞分离技术的培养效果。培养前,以4％台盼蓝染色判定肝细胞活性,培养48h后,观察肝细胞贴壁及生长状况。结果:①灌流消化法优于剪切消化法;②在多种灌流消化法中,经门静脉灌流消化法优于经胆总管灌流消化法及经腹主动脉灌流消化法;③在门静脉灌流的基础上,0.1％胶原酶Ⅰ37℃热消化10～15分钟,效果最好,而0.25％胰蛋白酶消化10～12分钟次之,用含EDTA的D-Hank液直接灌流分离法效果极差。结论:原代培养肝细胞的得率及活性与不同分离法包括灌流途径、灌流液、消化时间等有关。

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、原代培养与鉴定

【目的】探讨胎鼠肺泡Ⅱ型细胞原代培养及鉴定方法,建立肺泡Ⅱ型细胞培养模型,为体外研究肺泡Ⅱ型细胞及胎儿肺发育提供实验手段。【方法】采用低浓度胰酶消化20d胎鼠肺组织,经差速离心和特异性免疫吸附后,分离、纯化胎鼠肺泡Ⅱ型细胞,进行原代培养;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和肺表面活性特异蛋白A的分泌,用免疫细胞化学染色、透射电镜及酶联免疫吸附法对分离的细胞进行形态学和功能鉴定。【结果】原代培养的肺Ⅱ型细胞12h开始贴壁,外观呈多边形,岛状生长。培养的24～48h,细胞连接成单层,胞浆内颗粒明显,培养的6￣7d细胞内颗粒大量减少;免疫细胞化学鉴定细胞肺表面活性特异蛋白A(surfactantproteinA,SP-A)染色阳性,透射电镜可见观察到细胞内板层小体,培养液中SP-A含量随培养时间延长逐渐增多,于培养36h达峰值,为80ng/mL;细胞纯度达(92±2)%,产量为(18.6±7)×106。【结论】差速离心和免疫黏附法是一种高效的分离和纯化胎肺Ⅱ型细胞的方法,所得细胞产量大、纯度高,可以用于体外研究肺泡Ⅱ型细胞和晚期胎肺发育的研究。

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础。方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AECⅡ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant proteinc,SPC)的表达。结果:每3～5只胎鼠可获得AECⅡ(36±5)×106,活力98%±2%。镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形。透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上。结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AECⅡ,能满足体外进一步实验的需要。

大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。

新生大鼠小肠上皮细胞分离培养研究

本实验比较了4种分离大鼠IEC的方法,结果显示联合应用粗胶原酶和中性蛋白酶分离效果最好,细胞贴壁生长能力强。胶原涂膜改善玻璃培养瓶或盖玻片表面的性状有利于细胞贴壁生长。细胞的增殖依赖于培养液的质量、成分及细胞间的相互作用。培养细胞一般1～2天贴壁,7～8天明显增殖,10～14天汇合成片。培养细胞细胞角质蛋白、碱性磷酸酶染色阳性,光镜和电镜检查均显示为IEC。本文所建立的新生大鼠IEC体外培养方法为研究IEC生理和病理提供了一个十分有用的实验模型。

大鼠肺细小动脉平滑肌细胞培养新方法的建立及血小板衍生因子对其增殖迁移的影响

目的：建立一种操作简单、实验仪器要求低的大鼠肺细小动脉平滑肌细胞（PASMCs）分离和培养的方法，并且探索血小板衍生因子（PDGF）介导的增殖、迁移的情况。方法：向右心注射铁及琼脂糖，利用琼脂糖能同时粘附血管内皮细胞、平滑肌细胞及铁粉，再结合胶原酶I的消化，通过磁力架吸引铁，特异性地分选出带血管的肺组织，经过3～4周左右的培养及纯化，得到肺细小动脉平滑肌细胞。用倒置相差显微镜观察细胞形态，免疫细胞化学法和免疫荧光染色法进行小平滑肌肌动蛋白鉴定。MTT实验和划痕实验检测PDGF诱导的肺动脉细小平滑肌细胞的增殖和迁移。结果：分离后第14天、第21天及传代后进行鉴定，均表明分离培养的细胞为PASMCs。MTr结果表明，与不加PDGF组相比，PDGF增殖明显增加（P〈0．05）。划痕实验结果显示PDGF刺激组比不刺激组迁移显著增多。结论：本方法分离培养大鼠的PASMCs，操作方便，实验仪器要求低。PDGF能够促进肺细小动脉平滑肌细胞的增殖、迁移。

改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞

目的探讨改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞的效果及注意事项。方法2018年2-12月共解剖分离72只出生24 h内SD乳鼠的海马,采取Neurobasal+B27改良无血清法培养原代海马神经元细胞。铺板前使用Invitroge自动细胞计数仪计数存活及死亡细胞。细胞贴壁生长0 d、3 d、6 d、9 d、12 d时使用激光共聚焦显微镜观察神经细胞形态变化。结果平均每只乳鼠的海马可分离出(8.40±2.86)×10^(5)个神经细胞,其中存活细胞数为(5.48±1.73)×10^(5),死亡细胞数为(3.08±1.30)×10^(5),细胞总存活率为69%。细胞贴壁后第3天可观察到轴突长出,第6天树突长出,第9天和第12天可观察到周围神经细胞轴突、树突连成神经网络。贴壁后第3天胞体逐渐变大变饱满,最后呈扁圆形。细胞可存活4周左右。结论改良无血清法可用于培养原代海马神经元细胞,快速精准解剖分离及轻柔有效吹打海马组织是培养出高存活率和高活性原代海马神经元细胞的关键。

骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC),观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化,鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC,由门静脉注入肝移植受体,取肝组织冰冻切片,观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC,并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5 d,可在体外传代20代以上,具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100%。荧光显微镜观察,可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高,生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。

蓖麻油甾醇组成及其对大鼠蜕膜细胞的影响

目的进一步探明蓖麻油中的抗生育物质成分。方法利用皂化和萃取,从蓖麻油中提取甾醇,用GC-MS分析蓖麻油甾醇成分;用MTT法检测蓖麻油甾醇对原代培养大鼠蜕膜细胞活力的影响。结果蓖麻油总甾醇的主要成分为γ-谷甾醇(43.02%)、豆甾醇(27.15%)、岩藻甾醇(11.43%)、麦角甾-5-稀-3-醇(6.00%)和普罗布考(7.46%)。蓖麻油甾醇对细胞活力有抑制作用,其半抑制剂(IC50)剂量为:(88.45±3.196)μg/ml,r=+0.9549;抑制作用具有量-效关系。结论在蓖麻油甾醇的主要成分中,γ-谷甾醇(r-Sitosterol)可能是抑制原代培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分,而豆甾醇(stigmasterol)可能起协助的作用。

差速贴壁法在原代星形胶质细胞纯化中的应用

为获得高纯度的星形胶质细胞,在大鼠新生P0乳鼠大脑皮层的原代培养后,采用差速贴壁法予以纯化.经细胞免疫荧光染色鉴定,差速贴壁30min及1h处理获得的星形胶质细胞纯度高、状态好,能满足神经生物学研究中对高纯度星形胶质细胞培养的实验要求,适宜推广.

改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞

目的建立改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)。方法将SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒。在无菌条件下剖开胸腹腔,取出大鼠的心肺组织,然后用非体式显微镜分离方法分离出肺动脉血管段,去除肺动脉血管外层纤维结缔组织、破坏血管内膜层内皮细胞后,用组织块贴壁法培养PASMCs,并传代、冻存和复苏,倒置相差显微镜观察细胞形态,普通免疫细胞化学法和免疫荧光法进行细胞鉴定。结果大鼠PASMCs呈典型的"峰-谷"样生长状态,细胞形态呈梭形。α-SM actin蛋白在培养的大鼠PASMCs为阳性表达,传至第4代的PASMCs成活率可达98%,生长形态未见异常改变。PASMCs细胞从-80℃冰箱中取出复苏后,生长状态良好,形态、结构稳定。结论用改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs,较传统组织块贴壁法更简单,培养效率高。

大鼠肝星状细胞简便分离法及鉴定

目的：介绍一种简便、经济、稳定的大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）分离方法，为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法：取符合标准的雄性SD大鼠，体重约400-450g，行肝脏门静脉插管，灌洗肝脏后，先后采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I灌注，消化肝脏制成细胞悬液，20％Nycodenz密度梯度离心分离得到原代HSC。Desmin及α—SMA抗体免疫组化鉴定纯度。结果：HSC得率2×10^7／每肝，细胞存活率及纯度达95％以上。结论：该法简便、经济，细胞得率和纯度稳定，是一种实用的大鼠HSC分离方法。

不同分离方法对人卵巢颗粒细胞体外培养的影响

目的比较人卵巢颗粒细胞不同分离方法。方法取体外受精-胚胎移植(IVF-ET)采卵时的卵泡液,用裂解法、密度梯度离心法、酶解法分离纯化并原代培养人卵巢颗粒细胞。比较不同的分离方法获得的卵巢颗粒细胞数量、形态及其对早期培养的影响。结果裂解法得到的颗粒细胞数较密度梯度离心法、酶解法多(P<0.005,P<0.001);比较3种分离方法获得的卵巢颗粒细胞的活性和孕激素分泌量差异无统计学意义;接种24 h后,酶解法得到的卵巢颗粒细胞存活量最多(P<0.05),裂解法得到的存活细胞最少(P<0.05);裂解法获得的卵巢颗粒细胞继续培养48、72及96 h均较培养24 h有明显细胞增殖(P<0.05),且与其他组存活的细胞量差异无统计学意义。结论裂解法得到的颗粒细胞数量多,细胞生长较好,操作简单,是较理想的分离人卵巢颗粒细胞的方法。

肌条法与捣碎法分离培养鼠子宫平滑肌细胞效果对比研究

目的通过肌条捣碎法（捣碎法）与肌条分离法（肌条法）分离培养大鼠子宫平滑肌细胞,并比较两种方法的分离培养效果。方法取同等大小已除去内容物的SD大鼠的子宫组织部分,分别采用捣碎法和肌条法分离大鼠子宫平滑肌细胞,在倒置相差显微镜下观察所分离出的细胞数目并进行台盼蓝染色实验,检测细胞的存活率。结果倒置相差显微镜下观察显示分离得到的细胞呈圆形悬浮状,细胞计数显示捣碎法所得细胞数目平均为4.5×10^5个,肌条法所得细胞数目平均为2.5×10^5个;台盼蓝染色实验显示捣碎法所得的子宫平滑肌细胞存活率为66.6%,肌条法所得的子宫平滑肌细胞存活率为38.2%。结论捣碎法分离SD大鼠子宫平滑肌细胞效率高于肌条分离法,且前者子宫平滑肌细胞存活率高于后者,为鼠子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究提供基础技术支持。

大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

目的体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型。方法无菌取大鼠股动脉血管,胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD31阳性细胞,并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-8法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力,以Transwell法、Matrigel胶法检测其迁移和成管功能。结果胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在14~16 d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,细胞呈现典型铺路石状。流式检测其纯度为38.34%,分选后利用CD31进行荧光染色鉴定,细胞均为CD31阳性;PGE2可显著上调CD31阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能。结论该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型。

原代大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养扩增及鉴定

背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用。目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索。目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体。方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO2培养箱内进行原代培养。待细胞达80%-90%融合时,以1∶3的比例进行传代培养。倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验。结果与结论:(1)原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80%-90%,呈漩涡状排列;传至第3代时,细胞增殖迅速,接种48 h后即可再次传代,且细胞形态均一,呈现明显的鱼群样生长;(2)流式细胞仪检测结果显示CD90、CD73和CD29表达阳性,CD34、CD45和CD11b/c呈阴性表达;(3)第4代脂肪间充质干细胞成脂诱导7-10d后,细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形,胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴,经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色;而成骨诱导21 d后,细胞逐渐由长梭形变为多边形,呈聚集样生长,表面有大小不等的黑色小颗粒,局部有矿化样的结晶物;经茜素红染色后可见散在分布、大小不等的"蘑菇样"深红色球形结节;(4)由结果可见,该实验成功建立了一种简单、高效的大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法。