联合靶向Survivin和Livin的双重siRNA表达载体的构建及其活性鉴定

目的构建联合靶向凋亡抑制基因Survivin和Livin的双重siRNA表达载体并鉴定其活性,为研究同时下调Survivin和Livin表达的协同效应奠定基础。方法选取已证实有效的分别靶向Survivin和Livin的siRNA序列,通过定向克隆技术构建同时编码2个siRNA分子的真核表达载体pSilencer2.1-Sur-Liv,将其转染HepG2细胞后检测Survivin和Livin mRNA水平的变化,同时转染表达DsRed2-SURVIVIN和GFP-LIVIN的Hela荧光报告细胞观察荧光强度变化。结果双重siRNA表达载体pSilencer2.1-Sur-Liv构建成功,转染HepG2后Survivin和Livin mRNA水平明显下降,转染Hela报告细胞后荧光强度变弱。结论联合靶向Survivin和Livin的双重siRNA表达载体构建成功,并能有效下调Survivin和Livin的表达水平。

纳米凝胶搭载的siRNA通过靶向抑制施万细胞铁死亡促进周围神经损伤修复

目的:探究周围神经损伤(PNI)后施万细胞的死亡机制,使用纳米凝胶搭载的siRNA靶向抑制施万细胞死亡。方法:下载GEO数据库中PNI的转录组数据,依次进行数据处理、差异分析、GO功能富集分析、铁死亡通路鉴定以及靶基因的筛选。通过蛋白印记和qPCR实验验证靶基因的差异性。自组装单宁酸(TA)-siRNA纳米凝胶,通过丁达尔效应实验、粒径和电位测量、细胞吞噬实验、细胞骨架染色和CCK-8细胞活力实验鉴定纳米凝胶的物理学和生物学特性。通过划痕实验、免疫荧光染色实验、蛋白印记和qPCR实验验证TA-siRNA纳米凝胶抑制施万细胞铁死亡的有效性。结果:PNI后施万细胞出现明显的铁死亡现象,Bex1是调控施万细胞铁死亡的关键基因。TA-siRNA纳米凝胶具有优良的物理学和生物学特性,能够将siRNA成功地携带到损伤的施万细胞中并沉默靶基因,从而有效地抑制施万细胞损伤后的铁死亡。结论:纳米凝胶搭载的siRNA可以靶向抑制施万细胞铁死亡,为临床治疗PNI提供新的方向。

siRNA沉默人乳腺癌细胞株Livin基因的实验研究

目的探讨Livin-siRNA对人乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-30中Livin基因及蛋白表达的下调作用,以及对其增殖能力的影响。方法构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体,分别转染乳腺癌细胞后,通过实时定量PCR、Western blot技术检测人乳腺癌细胞MCF-7,ZR-75-30的Livin在mRNA、蛋白水平的表达。采用MTT法检测si-Livin2对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。结果成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体。它们不同程度地抑制了乳腺癌细胞Livin基因的表达,以si-Livin2抑制效率最高。si-Livin2作用于人乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-30后能明显抑制其Livin基因的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),并且能有效抑制细胞的增殖。结论Livin-siRNA能特异性抑制乳腺癌细胞的Livin mRNA及其蛋白的表达,抑制细胞增殖,为进一步研究沉默Livin基因对人乳腺癌细胞生物学功能的影响奠定了基础。

Livin基因在喉癌组织的表达及siRNA对喉鳞癌细胞影响的研究

目的:(1)研究Livin基因在喉癌组织中的表达;(2)设计siRNA沉默喉鳞癌细胞Livin基因,检测其细胞中Livin蛋白表达。方法:(1)采用免疫组织化学MaxVision法染色检测87例喉癌组织,79例癌旁组织及19例转移淋巴结中Livin蛋白的表达情况;(2)用Western blot对SH2-R、SH2-F、NC组的喉鳞癌细胞(hep-2)的Livin蛋白进行分析。结果:(1)喉鳞癌组织中Livin表达阳性率为71. 26%,显著高于癌旁喉组织。TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期喉癌阳性表达率为89. 28%,明显高于TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期喉癌;在喉鳞癌颈淋巴结转移阳性者Livin阳性表达率高达73. 68%,高于颈淋巴结转移阴性者。(2) SH2-R、SH2-F、NC组的Livin蛋白相对表达量以SH2-R组最低(12. 31±4. 43)%,SH2-R组与SH2-F、NC组比较有统计学意义。结论:Livin基因在喉癌组织中高表达;在体外,siRNA降低了喉鳞状细胞癌中Livin的表达。

Livin siRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌HeLa细胞的作用

【目的】构建和鉴定针对人抑凋亡基因livin的siRNA质粒载体,并研究其对宫颈癌HeLa细胞的作用。【方法】设计和合成针对人livin基因的siRNA寡核苷酸,定向克隆入质粒载体pmU6,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RT-PCR技术检测livin基因的mRNA表达水平,Western Blot技术检测Livin蛋白表达水平。用MTT法分析HeLa细胞增殖改变,流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化。【结果】livinsiRNA表达质粒能高效而特异地剔除HeLa细胞中livin的表达,抑制肿瘤细胞增殖(P<0.05),将HeLa细胞阻止在G1期。【结论】livin基因的siRNA对HeLa细胞增殖和细胞周期调控有重要影响,细胞凋亡可能是导致其细胞死亡的主要原因。

靶向肽在递送siRNA进行肺癌治疗研究中的应用

肺癌被认为是全球发病率最高的一种恶性肿瘤,其对化疗药物不敏感且易产生耐药性,因此增强肺癌药物治疗效果是近年来研究的热点。siRNA是一种小RNA分子,可以沉默与之互补的目标mRNA,是一种基因治疗手段。靶向肽是一类小分子多肽,它可以与siRNA联合使用,利用其与肿瘤表面物质特异性结合发挥靶向作用。联合靶向肽的特异性和siRNA的治疗作用,增加siRNA在靶点位置的聚集,增强沉默效果,可以提高肺癌对药物的敏感性并降低耐药作用,进而增强肺癌治疗效果,为肺癌的靶向治疗提供新的方向和策略。本文将对靶向肽在递送siRNA进行肺癌治疗研究中的应用作一简要综述。

干扰RNA的非靶免疫副作用及其siRNA序列设计与化学修饰

siRNA介导的RNA干扰技术已经成为基因功能研究和开展疾病治疗的有用工具.近年发现,siRNA在哺乳动物体内可激活天然免疫系统,诱导干扰素等炎症因子的分泌,并且可非特异性抑制某些非靶基因的表达,有可能极大限制RNA干扰技术的应用.进行高效特异性siRNA的设计和修饰,以保持或者增强siRNA的特异性靶基因沉默作用,又消除siRNA对机体的非靶免疫副作用,成为使siRNA安全有效应用于临床治疗的关键.

靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响. 方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列, 中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1, 构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察. 结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RT- PCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P<0.01). 结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.

siRNA沉默Livin基因表达对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响

目的:研究应用siRNA沉默Livin基因表达后肝癌细胞HepG2的生物学功能变化。方法:用脂质体lipofectamineTM2000将携带Livin基因的siRNA载体转染至HepG2细胞内,RT-PCR、Westernblot检测转染前后Livin基因mRNA和蛋白质的表达改变;流式细胞技术(FCM)和TUNEL检测转染前后肝癌细胞凋亡变化。结果:RT-PCR及Western blot检测发现转染siRNA后Livin基因的mRNA和蛋白质表达均明显下降(P<0.05);FCM检测发现实验组、阴性对照组和空白组肝癌细胞HepG2在G1期所占比例分别是(58.99±1.173)%、(41.85±2.82)%、(41.25±1.24)%,实验组与其他两组比较差异均有统计学意义(P<0.05);TUNEL技术检测表明实验组肝癌细胞HepG2凋亡数目明显增加,细胞凋亡率为(67.56±2.56)%,凋亡率明显高于阴性对照组(27.21±12.58)%和空白组(14.09±5.16)%(P<0.05)。结论:在肝癌细胞HepG2中,Livin基因沉默具有诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞生长的作用。

Livin基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对喉癌细胞HEP-2增殖的影响

目的构建及鉴定Livin基因siRNA慢病毒表达载体并观察其对喉癌细胞HEP-2增殖的影响。方法从基因库获得Livin基因序列,设计3段siRNA序列;经MluⅠ和ClaⅠ双酶切后克隆入慢病毒表达载体p Len OR-THM,构建p Len OR-THMLivin-siRNA重组质粒,将其转化感受态细菌DH5α,对阳性克隆进行筛选后,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切及测序鉴定正确后用脂质体转染293T细胞包装病毒颗粒,感染293T细胞及HEP-2细胞,用荧光定量PCR检测其对HEP-2增殖的影响。结果慢病毒表达载体p Len OR-THM-Livin-siRNA被成功构建;转染293T细胞组装病毒液有绿色荧光,并主要表达在细胞膜上;浓缩后的病毒液感染293T细胞及HEP-2细胞均有绿色荧光表达。SH2-R组的Livin蛋白相对表达量最低为(12.31±4.43)%;SH2-R组与SH2-F、NC组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了Livin基因siRNA慢病毒载体;HEP-2细胞Livin蛋白表达受到抑制。

Livin靶向si-RNA对胶质瘤TJ905干细胞及肿瘤坏死因子α的影响

目的从人脑胶质瘤TJ905细胞中分离肿瘤干细胞,制作livin基因干扰模型si-RNA livin,探讨livin靶向si-RNA对TJ905干细胞增殖及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法 TJ905细胞经免疫磁珠法分离获取肿瘤干细胞,构建干扰livin基因si-RNA,通过慢病毒转染干细胞建立干扰组,另设对照组转染空病毒,利用替莫唑胺(TMZ)干预,观察肿瘤干细胞的形态学改变,Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测细胞增殖,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测livin、TNF-α的表达。结果成功制作慢病毒转染TJ905干细胞livin靶向si-RNA模型。干扰组TJ905干细胞增殖活性及livin的表达较对照组显著降低(P<0.01)。相同药物浓度下干扰组TNF-α的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论Livin靶向si-RNA可能通过上调TNF-α基因的表达,并促使化疗药物TMZ对干细胞TNF-α的表达产生诱导作用,最终降低了干细胞的化疗耐药。

以适体作为载体介导siRNA靶向运输的研究进展

小干扰RNA(siRNA)通过RNAi途径沉默目的基因,因此其在疾病治疗领域的应用受到关注。如今siRNA作为药物应用于治疗的主要问题是如何将siRNA靶向传递到目标细胞或组织。适体是一种体外合成的单链DNA或RNA寡核苷酸,由于对靶分子有高特异性、穿透力强、低免疫原性等特点,适体可作为载体用于药物的靶向运输。本文主要介绍用适体介导siRNA靶向传递的研究进展。

针对DNMT3多靶点siRNA的构建及对肾细胞癌786-0细胞的影响

目的:设计、验证针对DNA甲基化转移酶3家族同源保守区域的多靶点siRNA,体内、外评价同时沉默DNMT3对肾细胞癌增殖、侵袭能力的影响。方法:基于DNMT3A/3B的同源保守区域,设计制作针对二者同源区域的2对siRNA序列(si DNMT3A/B-1及si DNMT3A/B-2),以Western印迹法验证沉默效率。转染肾细胞癌786-0细胞系后,分别以体外、体内实验验证其对于肾细胞癌增殖、侵袭能力的影响。结果:针对DNMT3A/B同源保守区siRNA序列,能够显著降低DNMT3A及3B的蛋白表达,并可以显著降低786-0细胞划痕迁移、增殖、侵袭能力,其侵袭、增殖关键基因(Ki-67、Vimentin、VEGF、CD31、MMP2)表达显著下调。体内研究证实,敲除组小鼠皮下瘤生长速度显著降低伴总体生存率显著延长(P<0.05),且皮下瘤内侵袭、增殖关键基因表达显著下调(P<0.05)。结论:基于DNMT3同源保守区域可获得多靶点有效siRNA;靶向下调肾细胞癌786-0细胞系DNMT3A及3B表达能够显著降低细胞增殖、侵袭能力;靶向DNMT3是肾细胞癌治疗的潜在靶点。

siRNA靶向抑制PDGFRB对人恶性脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的应用微小RNA干涉从mRNA靶向抑制PDGFRB基因/产物对人恶性神经胶质瘤细胞T98G、U87MG增殖作用的影响。方法脂质体转染法转染PDGFRB特异性siRNA;以传统半定量RT-PCR法及实时定量PCR观察应用特异性siRNA阻断PDGFRB的表达变化;采用MTT法检测恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。结果siRNA(PDGFRB-HSS107758和PDGFRB-B12)可明显抑制PDGFRB的表达(抑制率70%);PDGFRB特异性siRNA可抑制恶性胶质瘤细胞的体外增殖,对U87MG细胞增殖抑制作用显著(P<0.05)。结论PDGFRB特异性siRNA可以抑制恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的:设计构建重组体为转染肿瘤细胞,观察癌基因的沉默效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法:以c-myc为靶基因,以pEGFP-C1/U6质粒为载体,设计构建重组体,根据c-myc癌基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pEGFP-C1/U6中,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。

疏水化阳离子透明质酸胶束介导的siRNA转染影响因素及细胞靶向性研究

研究疏水化阳离子透明质酸胶束HAPL9600介导基因转染的影响因素。通过测定HAPL9600胶束与siRNA形成复合物的粒径,分别考察透明质酸相对分子质量、HAPL9600浓度、HAPL9600与siRNA比例、pH、介质、孵育时间以及血清对疏水化阳离子透明质酸胶束体外转染效率的影响,筛选较优的转染条件。同时进行受体抑制实验,考察该载体的细胞靶向性。结果表明当透明质酸相对分子质量为9 600、载体与siRNA质量比为8,孵育时间为30 min、体系中HAPL9600浓度为15 mg/mL,转染介质为pH 6.8的PBS溶液时转染效率较高。游离透明质酸可抑制经CD44介导的siRNA的转染效率。HAPL9600可作为合成新型靶向非病毒载体的骨架,但必须控制有关因素才能得到可重复的最佳转染结果。

livinβ-siRNA表达载体的构建及其在人星形胶质瘤细胞中的稳定表达

目的构建livinβ-siRNA表达载体,并观察其在人星形胶质瘤细胞(U251)中对livinβ基因表达的抑制。方法根据livinβ序列设计2条livinβ-siRNA特异性序列,PCR扩增方法合成2条siRNA链,与质粒pGenesil-11重组构建livinβ-siRNA表达载体,脂质体法转染人星形胶质瘤细胞(U251),RT-PCR和Western blot检测细胞中livinβ基因及蛋白表达。结果对重组质粒的双酶切鉴定和测序结果证明,livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA构建成功;RT-PCR检测转染组细胞中livinβmRNA表达水平明显低于对照组及空载体组,Western blot检测转染组细胞中livin蛋白表达水平明显低于对照组及空载体组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功构建了livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA,并且该载体能在真核细胞人星形胶质瘤细胞(U251)中稳定表达,并能抑制livinβ基因表达。

端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析

目的:体外研究siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性.方法:常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC-7721细胞株(EGFP-7721)和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF(EGFP-HELF).以PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为空白质粒组,siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为实验对照组,将siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EG-FP-HELF细胞作为实验组,用real-time SYBR Green PCR和Western Blot鉴定siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的影响.结果:正向和反向的重组质粒siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1转染EGFP-HELF细胞与空白质粒比较,EGFP基因表达无差异(P>0.05),而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后仅反向的siRNA-EG-FP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒抑制EGFP基因的表达(P<0.01).siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒与空白质粒组比较,在EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株间,EGFP基因的表达均具有统计学差异(P<0.01).结论:反向插入的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒在肿瘤细胞具有一定靶向性,为进一步探讨基因的靶向治疗奠定了基础.

支链siRNA多靶点对乳腺癌4T1细胞凋亡作用的影响

目的研究支链siRNA多靶点对乳腺癌4T1细胞凋亡作用的影响。方法采用MTT法检测支链siRNA多靶点在不同时间段(24 h、48 h及72 h)对乳腺癌细胞抑制作用;流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果细胞增殖活性:在24 h,Mixture组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0. 05);与其余实验组比较差异无统计学意义(均P>0. 05);在48 h,Mixture组分别与正常对照组及阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0. 05);与siRNA-STAT6组、siRNA-STAT5a及siRNA-STAT5b组比较差异有统计学意义(P<0. 05); siRNA-STAT3组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0. 05);在72 h,Mixture与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0. 05),与其余各实验组比较差异无统计学意义(均P>0. 05);流式细胞仪检测不同组别细胞凋亡率,Mixture组细胞凋亡率明显高于其他组,差异有统计学意义(P<0. 05)。结论支链siRNA多靶点可能通过抑制乳腺癌4T1细胞的增殖诱导细胞凋亡。