LCM联合快速免疫组化技术——一种获取肿瘤原位血管内皮细胞的可行途径

目的肿瘤血管内皮细胞对肿瘤发生发展极为重要,是目前肿瘤研究的热点。本研究为从肿瘤组织原位获取高纯度血管内皮细胞进行基因表达研究摸索可行方法。方法获取淋巴瘤组织标本后,置于锌固定液中固定,并通过进行激光捕获显微切割(lasercapture microdissection,LCM)前操作模拟LCM环境,确定锌固定法对RNA完整性的保护作用。将组织标本制作冰冻切片,采用快速免疫组化染色方法标记血管内皮细胞,利用LCM技术获取肿瘤组织原位血管内皮细胞,并用RT-PCR方法对所获细胞进行纯度检测。结果无论是固定后直接提取组织RNA,还是经模拟LCM环境再提取RNA,均显示锌固定法对RNA完整性提供了良好保护。快速免疫组化可以明确标记血管内皮细胞,后者能够被LCM准确捕获,并经RT-PCR验证为高纯度的血管内皮细胞。结论快速免疫组化联合LCM技术可以从肿瘤组织原位获取高纯度血管内皮细胞,并保证RNA的完整性,可能为肿瘤血管内皮细胞基因表达研究奠定基础。

应用LCM和蛋白质组学技术筛选肺腺癌的差异表达蛋白质

为筛选肺腺癌(lung adenocarcinoma,AdC)发病相关蛋白质,首先采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从AdC组织和正常支气管上皮(normal bronchial epithelium,NBE)组织中切割并收集AdC细胞和NBE细胞,再应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离经LCM收集的细胞蛋白质,通过PDQuest软件分析差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白质,组织芯片免疫组化方法检测差异蛋白质膜联蛋白A4(annexin A4)在30例AdC组织、配对的癌旁组织和淋巴结转移癌组织中的表达水平。研究结果显示,通过蛋白质组学方法建立了LCM收集的AdC和NBE细胞的2-DE图谱,质谱鉴定得到了33个差异表达蛋白质,其中21个蛋白质在AdC细胞中表达上调,12个蛋白质在AdC细胞中表达下调。组织芯片免疫组化结果显示,与癌旁肺组织相比,annexin A4在AdC组织中的表达水平显著上调,且在AdC淋巴结转移癌组织中的表达明显高于其原发癌组织。上述结果提示annexin A4与AdC的发病及淋巴结转移相关,有望成为诊断AdC及预测AdC转移的分子标志物。

激光捕获显微切割技术在植物基因组研究中的应用

植物的生长和发育在很大程度上取决于组织和(或)器官特异表达的基因,但要获取某一发育阶段的特异细胞类群来进行基因表达分析又是相当困难的。近年发展起来的激光捕获显微切割技术可以在显微镜下快速准确地获取单一的细胞类群,甚至单个细胞,成功地解决了组织中细胞的异质性问题。介绍了该技术的原理,并对其在植物中的应用进展情况做了综述,同时指出了该技术在植物中应用的可能发展方向。

激光显微切割联合功能分类表达谱芯片技术在脑缺血研究中的应用

目的探讨激光捕获显微切割分离大鼠脑微血管和神经元联合功能分类表达谱cDNA芯片技术在脑缺血研究的应用.方法激光捕获显微切割获取脑切片微血管和神经元,微量RNA提取试剂盒提取总RNA,线性扩增mRNA,紫外分光光度计定量所得aRNA(antisense RNA)扩增效率,基因特异性引物进行cDNA探针合成,进行芯片杂交反应.结果微血管和神经元各自捕获的总点数大约为8000～10000,T7线性扩增所得aRNA的量约为500～1000ng,探针合成效率高,杂交反应格局清晰良好.结论激光捕获显微切割,结合T7 RNA线性扩增及基因特异性引物线性扩增技术,可成功的应用于功能分类表达谱cDNA芯片的分析研究.

激光显微切割分离细胞的微量RNA质量鉴定体系的建立

探索一套激光显微切割(Laser capture microdissection,LCM)分离细胞后获得的微量RNA质量鉴定标准操作流程。选取3个低温保存的胃癌旁组织样本,冰冻切片进行甲酚紫染色和病理学检查,利用激光显微切割技术分离非癌上皮细胞,提取RNA并以Agilent 2100生物分析仪鉴定RNA的纯度和完整性。同时,选择高、中、低3种不同表达丰度的6个基因(EF1A,ACTB,GAPHD,B2M,MED1,CK20),在每个基因的5′和3′端设计引物,RT-PCR扩增。以3个培养细胞制备的高质量RNA和3个有降解的胃癌旁组织样本RNA作对照,RT-PCR扩增结果与Agilent 2100生物分析仪的结果高度一致。结果显示冻存组织进行冰冻切片结合病理学检查后,LCM获取细胞提取微量RNA采用RT-PCR进行质量鉴定是一种操作简单的稳定方法,可以作为肿瘤基因组研究的有效和常规方法。

激光捕获显微切割技术用于分离混合斑中精子细胞

目的评估激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术在分离混合斑中少量精子细胞的应用价值。方法配制不同比例的精液-阴道上皮细胞混合液,分别用差异裂解法和LCM法分离精子细胞,用磁珠法提取精子细胞DNA,并用IdentifilerTM试剂盒进行STR基因型检测。结果 LCM法分离精子细胞的STR成功率为92.86%(13/14),采用差异裂解法检测的成功率为7.14%(1/14),二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LCM法可有效排除女性细胞成分的干扰,并捕获少量精子细胞得到单一的男性STR分型,显著优于差异裂解法。

激光捕获显微切割技术应用研究新进展

对疾病发生过程中的组织损害要进行分子水平分析,首要步骤就是纯净目标细胞的分离。近年发展起来的激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)技术可以在显微镜直视下快速、准确地获取所需的单一细胞亚群,甚至单个细胞,从而成功解决了组织中细胞异质性问题。本文介绍了LCM技术的原理及其优缺点,并对其在DNA分析和基因表达分析两个方面的应用研究新进展进行综述,同时对LCM技术的发展和完善提出了可能的方向。

p53蛋白表达和基因突变在所谓肺硬化性血管瘤组织中的意义

背景与目的所谓肺硬化性血管瘤(socalledpulmonarysclerosinghemangioma,PSH)是一种至今不能肯定其来源及性质的少见肺肿瘤。虽然目前普遍认为PSH是一种良性肿瘤,但却发现有少数PSH可发生浸润和转移。p53蛋白表达和基因突变是反映肿瘤生物学行为的有用指标。本研究的目的是检测PSH组织中p53基因突变及p53蛋白的表达情况及其意义。方法应用免疫组化SP法、激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)技术、单链构象多态性(singlestrandedconformationpolymorphism,SSCP)及DNA测序分析方法(5～8外显子)检测19例PSH中多角形细胞和表面立方细胞的p53蛋白表达和基因突变情况。结果19例PSH组织中p53蛋白阳性表达率为21.1%(4/19),SSCP及测序分析检测p53基因突变率分别为26.3%(5/19)和42.1%(8/19)。p53蛋白阳性表达的4例PSH组织,测序分析显示3例标本有突变发生,2例为错义突变,1例同时发生错义突变和移码突变;而p53蛋白阴性表达的15例PSH组织中,5例标本经测序证实亦发生了突变,4例为移码突变,1例为错义突变。在有突变的8例PSH组织中,单一多角形细胞突变5例,单一立方细胞突变2例,多角形细胞和立方细胞同时突变1例。结论PSH组织p53蛋白阳性表达并不能完全反映p53基因突变的真实情况;p53基因突变或蛋白表达异常均可发生在PSH组织中的两种不同的细胞内;p53基因的高突变率提示PSH可能具有潜在的恶性生物学行为。

激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究

目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩,用RTPCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平。结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50000Shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCMShooting次数与可获得RNA量间对应关系。捕获细胞所提取的RNA中βactin基因表达完整。结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究。

激光捕获显微分离技术在DNA检验中的应用研究

目的建立一套显微细胞捕获技术用于法医学生物检材DNA检验方法。方法使用VeritasTM LCM激光捕获仪,采用紫外加红外的捕获方式,对框架覆膜玻片上经苏木素染色口腔上皮细胞进行捕获,采用改良硅珠法提取细胞DNA,使用Identifiler TM试剂盒在5μL体系中进行PCR扩增。结果成功获得20个口腔上皮细胞的13个以上完整STR基因座分型谱带。结论本研究建立的方法适合法医学生物检材制成的染色涂片上细胞的DNA检验。

激光捕获显微切割技术在强奸案中的检验研究

目的研究建立一套以激光捕获显微切割技术(LCM)分离强奸案混合样本的检验方法。方法通过不同的样本制备、染色并比较DNA分型结果,确立了以去离子水处理样本,苏木素或甲基紫染色制备样本并经细胞涂片、切割收集进行DNA检测与分型的方法。结果建立的方法能从15个上皮细胞、50个精子细胞中稳定检出正确且完整的STR分型。结论本实验方法可用于强奸案中混合斑的检验。

胃癌组织中hmlH1蛋白表达及其突变的研究

目的探讨hmlH1基因与胃癌的发生及临床病理特征的关系。方法应用SP法检测胃癌组织hmlH1蛋白表达;应用激光捕获显微切割技术获取所需细胞,聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)-银染技术检测胃癌hmlH1基因突变。结果胃窦部胃癌、无淋巴结转移、乳头状及管状腺癌、高分化腺癌及早期胃癌组中hmlH1蛋白表达缺失率与对应组比较显著增高(P<0.05);胃癌hmlH1基因5个外显子总突变率为6.12%,与胃癌的临床病理特征均无显著相关(P>0.05);hmlH1蛋白表达阳性胃癌组与hmlH1蛋白表达缺失组的hmlH1基因突变率,无显著性差异(P>0.05)。结论hmlH1蛋白表达缺失与部分胃癌的发生有关,hmlH1蛋白表达缺失的胃癌有特殊的临床病理特征和发病机制。hmlH1基因突变可能参与胃癌的发生,且可能是引起胃癌中该蛋白表达下调原因之一。

乳腺癌蛋白质组研究进展

乳腺癌是发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤,其发病率占女性恶性肿瘤首位。近年来,蛋白质组研究广泛深入乳腺癌发病机理、临床早期诊断和治疗等各个方面。本文比较系统地综述了乳腺蛋白质组研究的样品处理、研究技术和研究成果。

激光捕获显微切割技术的研究进展

介绍了激光捕获显微切割系统(LCM)的原理、发展历程和主要应用,并对目前利用LCM技术存在的瓶颈作了分析和展望。

蛋白质组学的相关技术研究进展

目前,生物学研究已进人后基因组时代,一个以“蛋白质组”为研究重点的生命科学新时代已悄然到来。近年来,蛋白质组技术发展迅速,激光捕获微切割、蛋白质芯片、同位素包被亲和标记等新技术,促进了蛋白质组学的发展。综述了近年蛋白质组学相关新技术的进展及其应用情况。

DS-1-47促着床的靶点分子筛选研究

目的研究筛选DS-1-47促着床的分子靶点。方法采用皮下注射吲哚美辛的方法建立胚泡着床障碍动物模型,动物随机分为正常组(N)、模型组(M)和中药组(Z),运用蛋白组学激光捕获显微切割技术-二维电泳-质谱(LCM-DE-MS)的技术路线研究分析DS-1-47作用前后子宫组织中蛋白分子的变化,筛选得到DS-1-47促进着床的关键分子,从而深入阐明其发挥作用的分子机制。结果 Z组能使11种蛋白质的表达发生明显改变,其中3种蛋白质的表达M组较N组明显下调,Z组较M组明显上调,这3种蛋白质经鉴定分别为肝羧酸酯酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、载脂蛋白A-Ⅰ;另外8种蛋白质的表达M组较N组明显上调,Z组较M组明显下调,蛋白质分别为血液结合素、激肽原-1、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、α-1-抗胰蛋白酶1-3、结合珠蛋白、延伸因子-1-Δ、膜联蛋白A5、血清淀粉样蛋白P成分。结论血液结合素、结合珠蛋白、载脂蛋白A-Ⅰ、膜联蛋白A5、激肽原-1、延伸因子-1-Δ、丝氨酸蛋白酶抑制剂等可能是复方DS-1-47促进着床的重要靶点。

利用激光显微切割与microarray技术对恒河猴脑中白质与灰质基因表达的差异性的研究

目的:利用激光显微切割技术和microarray技术比较恒河猴脑组织中前额叶皮质(prefontal cortex,PFC)与小脑皮质(cere-bellar cortex,CBC)的灰质与白质基因表达的差异。方法:利用激光显微切割技术(laser capture dissection,LCM)与microarray技术的有效结合,提取恒河猴PFC与CBC的白质与灰质,分别提取RNA,合成cDNA文库。最后利用GeneChip 1.0 ST芯片技术,分析得出大脑与小脑中灰质与白质的表达差异性。结果:无论是灰质还是白质,在PFC中的高表达基因都要远远多于在CBC中的高表达基因。结论:使用LCM可以提取单一的细胞群,从而用于要求更为精确的实验当中。

哺乳动物单细胞研究技术的现状与未来

近年来,生命科学和医学的基础研究已深入到单细胞阶段。单细胞研究为揭示生命活动的基本规律、探索细胞异质性、提高对疾病发病机制的认识等提供了重要的线索和依据,同时,单细胞技术已被应用于日常实践中,如法医学和临床生殖医学。单细胞研究中使用的技术也在不断变化,并越来越复杂。文中主要介绍单细胞分离技术,包括手工挑取、激光捕获显微切割和微流控技术,以及单细胞中DNA、RNA和蛋白质分析方法的各种技术。此外,文中总结了近年来生命科学和医学领域的主要单细胞研究成果,讨论了单细胞相关技术和研究的不足,并介绍了其未来的发展方向。