用电穿孔技术向Ψ－2细胞导入EBV Lmp基因的研究

采用电穿孔基因转移技术向Ψ－２细胞内导入ＥＢＶＬｍｐ一ｎｅｏ基因，通过Ｇ４１８筛选获得８６个抗性克隆。用ＰＣＲ检测进一步确定了外源基因在抗Ｃ４１８克隆中稳定的整合。研究了部分电学参数对细胞存活及基因转移效率的影响以及电穿孔基因条件的优化。

LMP2/LMP7基因多态性与乙型肝炎病毒感染结局的关系

目的:探讨低相对分子质量蛋白酶体(LMP)基因单核苷酸多态性(SNP)与HBV感染结局之间的关联.方法:提取287例HBV持续感染者(包括无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化患者)及278例健康对照外周血基因组DNA,用PCR-RFLP方法分析LMP2/LMP7基因Codon60/Codon145两个多态性位点的基因型.结果:LMP7基因多态性位点在健康对照与无症状HBV携带者之间的差异有统计学意义(P<0.05),与携带Gln/Gln基因型者比较,携带Gln/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加3.35倍(95%CI:2.02-5.58),携带Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加3.46倍(95%CI:1.41-8.48),携带至少1个Lys等位基因者(即Gln/Lys和Lys/Lys基因型)乙型肝炎患病风险增加3.37倍(95%CI:2.06-5.52);;LMP7基因多态性位点在健康对照与进展性肝炎(包括慢性乙型肝炎和肝硬化)患者之间的差异有统计学意义(P<0.05),与携带Gln/Gln基因型者比较,携带Gln/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加2.22倍(95%CI:1.48-3.32),携带Lys/Lys基因型者乙型肝炎患病风险增加4.33倍(95%CI:2.15-8.73),携带至少1个Lys等位基因者(即Gln/Lys和Lys/Lys基因型)乙型肝炎患病风险增加2.49倍(95%CI:1.69-3.65);;LMP2/LMP7基因多态性位点在无症状HBV携带者与进展性肝炎患者间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:LMP7基因可能是无症状HBV携带和进展性肝炎的易感基因;;LMP基因多态性与HBV感染的结局可能无明显相关性.

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端XhoⅠ酶切位点的丢失

背景与目的;众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法:收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAampDNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho Ⅰ对扩增产物进行酶切。采用四色荧光 末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果:10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79.37％)出现Xho Ⅰ酶切位点的丢失(Xho Ⅰ-loss),还有4例(6.34％)为Xho Ⅰ酶切位点部分丢失,只有9例(14.29％)未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失(wt-Xho Ⅰ)。除了Xho Ⅰ酶切位点的丢失(nt:169423～169428;GAGCTC→GA T CTC)外,还发现四个错义点突变。结论:本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt-Xho Ⅰ,而在鼻咽癌组织中主要为Xho-Ⅰ-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失和其?

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立

目的:建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型,为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具.方法:通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产3wk龄子代鼠进行PCR初选,再通过Southern杂交进一步确证;利用HE染色法观察4mo龄转基因小鼠不同组织病理变化.结果:将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射,然后植入30只假孕母鼠的输卵管中,其中26只母鼠怀孕,移植成功率为86.67%;共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因,转基因阳性小鼠比例为5.03%(9/179),Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠;随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症,鼻咽黏膜上皮灶性增生.结论:成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠,且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生,可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.

我国北方地区鼻咽癌患者EB病毒LMP1基因缺失分析

为研究我国北方地区鼻咽癌和非鼻咽癌患者Epstein Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)基因C端区缺失状况,探讨其在鼻咽癌发生中所起的作用。收集我国东北地区鼻咽癌石蜡组织22例,非鼻咽癌患者外周血26例,提取DNA后,采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增LMP1基因的C末端,对其中有缺失的4例鼻咽癌进行了克隆和序列分析。结果显示:22例鼻咽癌组织标本中,有19例扩增出特异性条带,阳性率为86%。其中8例存在缺失,缺失率42%。取4例缺失样品进行序列分析,并与B95-8原型LMP1做比较,结果显示:4例鼻咽癌样品均存在30个碱基的缺失和某些位点的单点突变,并由此引起所编码的氨基酸改变。26例非鼻咽癌患者LMP1阳性扩增率为92 31%,无一例缺失。此结果表明:与广东、广西鼻咽癌高发区相比,我国北方地区鼻咽癌与非鼻咽癌患者中EB病毒LMP1基因缺失型和原型的分布有明显的地区差异。

EB病毒LMP1基因C端区缺失突变与肿瘤发生相关性的Meta分析

目的探讨Epstein-Barr(EB)病毒LMP1基因C端区缺失突变与肿瘤发生的关系。方法通过计算机检索Cochrane Library、PubMed、EMBASE、中文期刊全文数据库、维普中文科技期刊数据库、中国知网全文数据库(CNKI)等数据库中发表于1995年1月～2012年5月的与EB病毒LMP1 30 bp缺失相关的文献,根据文献纳入标准提取相关数据。采用Stata 11.0软件进行Meta分析,计数资料采用OR及95%CI表示,对病例组、对照组LMP1基因C端区30 bp缺失进行分析。各组中研究异质性无统计学意义(P≥0.1)时采用固定效应模式分析,否则采用随机模式分析。结果纳入针对EB病毒LMP1基因C端区缺失突变的文献共13篇。通过对纳入的文献进行Meta分析发现,LMP1 30 bp缺失与肿瘤发生相关,95%CI为2.88(1.29～6.41),合并统计值Z=2.59,P=0.01。结论 EB病毒LMP1基因C端区的缺失突变与肿瘤发生存在相关性。

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

背景:与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的:构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法:双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP),以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论:测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。

含突变型p53和LMP1双基因重组质粒的构建与鉴定

目的构建一种双基因真核表达载体,使之表达人突变型p53蛋白(p53mt)和EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1),为研究这两个蛋白在鼻咽癌变中的交互作用奠定基础。方法通过基因重组技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1—p53mt;采用脂质体lipofectAMINETM2000将此载体转入体外培养的HeLa细胞中,转染后48h,采用免疫细胞化学方法分析突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达。结果对重组载体进行限制性内切酶酶切及PCR鉴定分析,结果与预期相符合;转染试验观察到转染细胞中突变型p53基因和LMP1基因的阳性表达。结论成功构建了表达人突变型p53蛋白和EB病毒LMP1的真核载体pLMP1—p53mt,其研究思路可以为中医体质病机研究提供借鉴。

腺病毒携带EB病毒LMP1反义基因抑制人鼻咽癌细胞的生长

目的研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法用反义LMP1DNA的腺病毒载体AdEasy-GFP-ALMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2,Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达;用MTT法和细胞生长曲线实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞;转染后LMP1蛋白表达降低;转染后细胞活力和生长速度均有下降。结论将反义LMP1腺病毒载体导入细胞能成功抑制CNE2细胞的生长,逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。

广州地区鼻咽癌EB病毒LMP1基因N端XhoI酶切位点的丢失

目的 检测广州地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N -末端区XhoI酶切位点的丢失 ,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法 收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌新鲜活检标本 63例以及EB病毒健康携带者外周血单个核细胞 10例。采用QIAampDNAMiniKit和QIAampDNABloodMiniKit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA ,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N -末端区 ,并用XhoI对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果 10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N -末端区均未见XhoI酶切位点的丢失。 63例鼻咽癌组织中有 5 0例 ( 79%)出现XhoI酶切位点的丢失 (XhoI -loss) ,4例 ( 6%)为XhoI酶切位点部分丢失 ,只有 9例 ( 14 %)未见XhoI酶切位点的丢失 (wt -XhoI)。除了XhoI酶切位点的丢失 (nt:16942 3～16942 8;GAGCTC→GATCTC)外 ,还发现 4个错义点突变。结论 广州地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt -XhoI ,而在鼻咽癌组织中主要为XhoI -loss。因此 ,我们认为EB病毒LMP1基因N -末端区XhoI酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。

肺癌EB病毒LMP1基因片段的检测及变异株的意义初探

目的:研究ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因与肺癌的关系,并对其变异株进行分析。方法:应用多聚酶链反应检测了４０例肺癌ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因片段,并对其进行克隆及测序分析。结果:４０例肺癌标本中,１１例(２７．５%)阳性;对１１例ＥＢＶ－ＬＭＰ１ ＤＮＡ阳性产物用限制性内切酶ＳｔｙⅠ酶切消化,发现９例与标准病毒完全一致,２例不同,提示ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因有变异存在。结论:ＥＢ病毒的感染及ＬＭＰ１基因片段的变异在肺癌的发生、发展中可能发挥着一定的作用。

云南汉族人群LMP基因多态性与丙型肝炎病毒慢性感染的相关性

目的探讨低分子量蛋白酶体（low molecular weight polypeptide, LMP）基因多态性与丙型肝炎病毒（hepatitis C virus , HCV）慢性感染的相关性。方法选择云南地区汉族人群HCV慢性感染患者427例，健康对照者412名，采用TaqMan探针基因分型方法对LMP2基因单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism, SNP）rs1351383、rs17587、rs2127675和LMP7基因SNPrs2071543进行基因分型，并构建单倍型，统计LMP2和LMP7多态性位点的等位基因频率与基因型频率、单倍型频率，分析SNPs及单倍型与HCV慢性感染的相关性。结果病例组和对照组LMP2基因rs1351383和rs2127675的等位基因频率差异有统计学意义（P〈0．05），rs1351383／rs17587／rs2127675单倍型A-pA和C-G-G差异有统计学意义（P〈0．05）；其他位点基因型、等位基因型、单倍型频率在病例组和对照组中差异无统计学意义（P〉0．05）。结论在云南汉族群体中，LMP2基因SNPrs1351383C等位基因和rs2127675G等位基因可能是HCV慢性感染的易感因素，rs1351383／rs17587／rs2127675单倍型A-GA可能是HCV慢性感染的保护因素，单倍型C-G-G可能是HCV慢性感染的危险因素。

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠,观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论反义LMP1能成功抑制LMP1的表达,逆转NPC细胞的恶性表型,为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。

脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1的表达

目的探讨10～23脱氧核酶(10～23DRz)对鼻咽癌生长的抑制作用。方法设计合成针对EBV-LMP1的10～23DRz,并对其进行硫代磷酸化修饰,同时针对该位点设计突变型DRz和反义寡核苷酸,经脂质体转染C666-1细胞中观察其对LMP1基因因表达的抑制效应;建立裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤,瘤体内注射脱氧核酶及其类似物,观察其对LMP1基因因及肿瘤生长的抑制效应。结果有效转染后,脱氧核酶在细胞内抑制LMP1基因因表达;成功建立裸鼠移植瘤模型后,脱氧核酶能高效抑制LMP1基因因表达,并能抑制肿瘤生长,其作用较突变型脱氧核酶和反义寡核苷酸强(P<0.05)。结论脱氧核酶在鼻咽癌细胞中及移植瘤模型中都能高效抑制LMP1的表达,可能成为一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的 研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法 用反义LMP1DNA的真核表达载体anti pcDNA3.1 LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2 ,G4 18筛选抗性克隆 ;Western blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达 ;用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果 建立反义CNE2细胞克隆 ;转染后LMP1蛋白表达降低 ;转染后细胞活力和生长速度均有下降 ,集落形成能力显著降低。结论 将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长 ,逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体,并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法:用EcoR I和Not I将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后,克隆到毕氏酵母载体PICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA-LMP2A。pICZαA-LMP2A经Sac I酶切线性化,采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株,用PCR鉴定阳性酵母转化子,并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳和western-blotting分析。结果:重组质粒pPICZαA-LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS-PAGE电泳和western-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54 Kda,与预计值相同。结论:构建了LMP2A毕氏酵母表达载体,并在酵母细胞中成功表达。

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础。方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况。结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达。结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒。

鼻咽癌基因研究进展

肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病 ,对于肿瘤癌基因和抑癌基因的研究具有重大意义 ,其中与鼻咽癌相关的癌基因以及候选瘤基因有LMP1基因、bcl -2基因、ras基因、c -erbB -基因、Tx基因、NAG2 3 FBXO3 0基因等 ,抑癌基因及候选抑瘤基因有p5 3、p16基因、p13 0 Rb2基因、nm2 3基因、NAG7基因、NAG11基因、NAG12基因、UBAP1基因、YH1基因、NGX6基因等 ,这些基因在鼻咽癌发生、发展过程中有着重要作用。

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6-LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE-1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE-1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE-1和CNE-1-LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4(death receptor 4,DR4),死亡受体5(death receptor,DR5)表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE-1细胞中caspase-8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase-3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE-1-LMP1细胞,而Bcl-2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式(truncated form of Bid,t Bid)和caspase-9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC-1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论 LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。