黄芪糖蛋白干扰lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴抑制细胞焦亡改善佐剂性关节炎大鼠心肌损伤

目的基于长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5/微小RNA 21/Toll样受体4(lncRNA GAS5/miR-21/TLR4)信号轴探究黄芪糖蛋白(HQGP)对佐剂性关节炎(AA)大鼠心肌损伤的作用及机制。方法将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、甲氨蝶呤(MTX)组、HQGP组,每组6只。复制AA模型,第19天开始给药,连续4周。检测各组AA大鼠足趾肿胀度、关节炎指数(AI),HE染色观察大鼠心肌组织病理变化,透射电镜观察心肌组织超微结构的变化及焦亡小体情况,ELISA检测血清白细胞介素6(IL-6)、IL-18、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测心肌组织LDH释放量,实时荧光定量PCR检测心肌组织核因子κB p65(NF-κB p65)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)的mRNA以及lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴分子的表达,Western blot法检测心肌组织TLR4、NF-κB p65、caspase-1、NLRP3和GSDMD蛋白水平。结果与正常对照组相比,模型组大鼠足趾肿胀度、AI显著升高;大鼠心肌纤维溶解、断裂,肌节结构模糊,心肌纤维排列紊乱,组织间有炎性细胞浸润,线粒体嵴明显断裂稀疏,焦亡小体数量增加;血清促炎细胞因子IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α表达显著升高;心肌组织中GAS5表达显著降低,miR-21表达显著升高,LDH释放量、TLR4、NF-κB p65、caspase-1、NLRP3、GSDMD的mRNA和蛋白表达水平显著升高。与模型组比较,HQGP组大鼠足趾肿胀度、AI和心肌组织病理状态明显改善;血清IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α表达显著降低;心肌组织中GAS5表达显著升高,miR-21表达显著降低,LDH释放量、TLR4、NF-κB p65、caspase-1、NLRP3的mRNA和蛋白表达水平显著降低,GSDMD的mRNA表达降低且蛋白水平显著降低。结论HQGP通过上调lncRNA GAS5抑制miR-21/TLR4信号传导,抑制细胞焦亡,减少促炎细胞因子表达,改善AA大鼠心肌损伤。

雷公藤甲素通过lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴抑制细胞焦亡改善佐剂型关节炎大鼠炎症

目的探讨雷公藤甲素(TP)通过lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴抑制细胞焦亡改善AA大鼠炎症的机制。方法将大鼠分为4组,每组6只:正常组(NC),模型组(MC),雷公藤甲素组(TP)和甲氨蝶呤组(MTX)。建立AA大鼠模型,观察大鼠一般状态、右足跖肿胀度和关节炎指数;HE染色检测各组大鼠关节滑膜组织病理形态;ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子水平;荧光定量PCR检测Caspase-1、IL-1β、NLRP3、GSDMD、GAS5、TLR4、NF-κB、miR-21 mRNA表达水平;Western blot检测Caspase-1、NLRP3、GSDMD、NF-κB、Caspase-4、TLR4蛋白的表达情况。结果与NC组比较,MC组大鼠肿胀度、关节炎指数显著升高(P<0.05),炎性细胞浸润增加;与MC组比较,TP组和MTX组IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子水平下降(P<0.05),Caspase-1、IL-1β、NLRP3、GSDMD、TLR4、NF-κB、miR-21 mRNA表达水平减少,GAS5 mRNA表达增加(P<0.05),Caspase-1、NLRP3、GSDMD、NF-κB、Caspase-4、TLR4蛋白水平下降(P<0.05);与MTX组比较,TP组IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子水平下降(P<0.05),Caspase-1、IL-1β、NLRP3、GSDMD、TLR4、NF-κB、miR-21 mRNA表达水平减少(P<0.05)。结论雷公藤甲素可能通过lncRNA GAS5/miR-21/TLR4信号轴,抑制细胞焦亡,抑制促炎因子产生,改善AA大鼠炎症。

miR-21-5p抑制TLR4诱导皮肤鳞状细胞癌细胞增殖

目的研究TLR4与miR-21-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的影响及两者的靶向关系。方法通过免疫组化法检测皮肤鳞状细胞癌组织中的TLR4表达,通过Toll样受体4(TLR4)质粒和miR-21-5p inhibitor转染过表达细胞中的TLR4和抑制细胞中miR-21-5p,通过生物信息学分析TLR4与miR-21-5p的关系,通过RT-qPCR检测细胞中TLR4和miR-21-5p的表达,通过CCK8检测A431细胞生长情况,通过Western bloting检测细胞中TLR4和增殖分子ki-67的表达。结果TLR4在皮肤鳞状细胞癌癌旁组织中表达最高,且在低分化组织中表达低于高分化组织,差异有统计学意义(P<0.05),TLR4在A431人皮肤鳞状细胞癌细胞中表达低于HaCaT人永生化角质形成细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-21-5p可能是TLR4的潜在miRNA靶基因。A431细胞过表达TLR4,发现细胞增殖抑制,差异有统计学意义(P<0.05),miR-21-5p表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。A431细胞抑制miR-21-5p表达,发现细胞增殖抑制,差异有统计学意义(P<0.05),TLR4表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-21-5p与TLR4的相互调节影响A431细胞的增殖,miR-21-5p与TLR4的相互作用在皮肤鳞状细胞癌的细胞行为中发挥重要作用。

lncRNA MALAT1调节miR-106b-5p/TLR4轴对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织炎性损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(lncRNA MALAT1)调节miR-106b-5p/Toll样受体4(TLR4)轴对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织炎性损伤的影响。方法以气管滴注脂多糖溶液并联合烟熏法构建COPD模型大鼠,随机分成5组(每组12只模型大鼠):模型组、lncRNA MALAT1敲低组、miR-106b-5p antagomir组、阴性对照组、lncRNA MALAT1敲低+miR-106b-5p antagomir组,选12只正常大鼠气管内滴注与造模大鼠等剂量的生理盐水,且不进行烟熏,作对照组,分组干预处理后,检测大鼠肺功能,比较各组用力肺活量(FVC)、呼气峰流值(PEF)、吸气阻力(Ri)、潮气量(VT);实时荧光定量PCR实验检测肺组织lncRNA MALAT1、miR-106b-5p及TLR4 mRNA表达;Giemsa染色对肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数;HE染色观察各组大鼠肺组织炎性损伤,并做Holfbauer评分;酶联免疫吸附测定(ELASA)法测量各组大鼠BALF和血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-10(IL-10)水平;双荧光素酶报告基因实验检测L2细胞中lncRNA MALAT1对miR-106b-5p、miR-106b-5p对TLR4的靶向调节。结果与对照组比较,模型组大鼠肺组织发生炎性损伤,FVC、PEF、肺组织miR-106b-5p表达、BALF和血清中IL-10水平降低(P<0.05),Ri、VT、肺组织lncRNA MALAT1及TLR4 mRNA表达、Holfbauer评分、BALF中白细胞计数、BALF和血清中TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05)。与模型组比较,lncRNA MALAT1敲低组大鼠肺组织肺炎性损伤减轻,FVC、PEF、肺组织miR-106b-5p表达、BALF和血清中IL-10水平升高(P<0.05),Ri、VT、肺组织lncRNA MALAT1及TLR4 mRNA表达、Holfbauer评分、BALF中白细胞计数、BALF和血清中TNF-α、PGE2水平降低(P<0.05);miR-106b-5p antagomir组大鼠肺组织肺炎性损伤加重,FVC、PEF、肺组织miR-106b-5p表达、BALF和血清中IL-10水平降低(P<0.05),Ri、VT、肺组织TLR4 mRNA表达、Holfbauer评分、BALF中白细胞计数、BALF和血清中TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05);阴性对照组大鼠各指标无显著差异(P>0.05)。与lncRNA MALAT1敲低组比较,lncRNA MALAT1敲低+miR-106b-5p antagomir组大鼠肺组织肺炎性损伤加重,FVC、PEF、肺组织miR-106b-5p表达、BALF和血清中IL-10水平降低(P<0.05),Ri、VT、肺组织lncRNA MALAT1及TLR4 mRNA表达、Holfbauer评分、BALF中白细胞计数、BALF和血清中TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05)。L2细胞中lncRNA MALAT1可靶向下调miR-106b-5p,且miR-106b-5p可靶向下调TLR4表达。结论下调lncRNA MALAT1可通过促进miR-106b-5p分泌而降低TLR4表达,进而减少促炎因子产生,增加抗炎因子产生,阻止炎症发生发展,最终减轻COPD大鼠肺组织炎性损伤。

长链非编码RNAGAS5抑制内皮细胞功能

最新研究表明,长链非编码RNA GAS5(lncRNA GAS5)可调节血管内皮细胞的凋亡,但对内皮细胞其他功能的调控并不明确。本研究旨在了解lncRNA GAS5对内皮细胞的增殖、成血管、NO分泌及内皮标志分子CD31和v WF表达的影响及可能机制。将LncRNA GAS5干扰慢病毒(LVGAS5-RNAi)转染人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)后,采用CCK8及Matrigel胶分别检测EA.hy926的增殖和成血管能力;硝酸还原酶法检测NO的分泌情况;real-time RT-PCR检测CD31、v WF及miR-21的表达;Western印迹检测PTEN在蛋白质水平的表达。结果显示:与对照组比较,LVGAS5-RNAi组EA.hy926增殖能力无明显变化(0.34±0.01 vs.0.34±0.04,P>0.05),而其成血管能力升高(133.70±12.64 vs.100.00±4.65,P<0.05),NO的分泌量亦增加(28.54±2.75μmol/L vs.15.11±1.19μmol/L,P<0.01);内皮标志分子CD31(是对照组的1.46倍)及v WF(是对照组的2.94倍)的基因表达量均显著升高。同时,miR-21表达亦明显升高(是对照组的1.42倍),而miR-21下游靶基因PTEN蛋白质的表达量则显著降低(0.13±0.05 vs.0.38±0.03,P<0.01)。以上结果提示,LncRNA GAS5抑制了内皮细胞的功能,miR-21、PTEN信号分子可能参与其中的调节。

荣筋拈痛方对膝关节软骨细胞外基质代谢的作用及机制

背景:课题组前期动物实验研究表明,荣筋拈痛方可通过LncRNA GAS5/miR-21影响软骨基质分解和合成代谢,以达到防治膝骨关节炎的作用。LncRNA GAS5/miR-21能否作为防治膝骨关节炎的靶点,仍需从细胞水平研究验证。目的:从细胞水平探讨荣筋拈痛方防治膝骨关节炎的作用机制。方法:(1)8周龄SPF级雄性SD大鼠40只,随机分组后给予生理盐水、荣筋拈痛方(0.45 g/mL)、盐酸氨基葡萄糖胶囊(0.015 g/mL)灌胃,制备含药血清。(2)分离培养SD大鼠膝关节软骨细胞,采用白细胞介素1β干预软骨细胞,诱导退变软骨细胞模型,采用CCK-8法明确含药血清干预软骨细胞的量效时效关系。(3)将第2代软骨细胞分为空白组(空白血清)、模型组(白细胞介素1β+空白血清)、治疗组(白细胞介素1β+荣筋拈痛方含药血清)、对照组(白细胞介素1β+盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清)诱导干预48 h,Real-time PCR法和Western blot法检测各组软骨细胞血清干预后LncRNA GAS5、miR-21、基质金属蛋白酶抑制物3(tissue inhibitor of metalloproteinases 3,TIMP-3)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)3、MMP-9、MMP-13和解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-5)基因及蛋白表达。(4)慢病毒转染软骨细胞过表达LncRNAGAS5,分为LncRNAGAS5空载体+空白血清组、LncRNAGAS5空载体+荣筋拈痛方含药血清组、LncRNA GAS5过表达+空白血清组、LncRNA GAS5过表达+荣筋拈痛方含药血清组,各组干预后Real-time PCR检测LncRNA GAS5、miR-21、TIMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表达。结果与结论:(1)荣筋拈痛方含药血清体积分数为10%、培养48 h;盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清体积分数为15%、培养48 h,能显著提高软骨细胞活性;(2)干预48 h后,与模型组相比,荣筋拈痛方含药血清和盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清均能抑制Lnc RNA GAS5、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因和蛋白的表达(P<0.05),促进miR-21、TIMP-3基因和蛋白表达(P<0.05);(3)与空载体组相比,LncRNAGAS5过表达组LncRNA GAS5、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表达量明显升高(P<0.05),miR-21、TIMP-3基因表达量明显降低(P<0.05);与LncRNAGAS5过表达+空白血清组相比,LncRNAGAS5过表达+荣筋拈痛方含药血清组MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5mRNA表达量均降低(P<0.05),miR-21、TIMP-3基因表达量升高(P<0.05);(4)结果表明,荣筋拈痛方通过调控LncRNA GAS5/miR-21,促进TIMP-3的表达,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5等表达,从而延缓退变软骨细胞外基质降解,起到防治膝骨关节炎的作用。

HBV宫内感染孕妇血清LncRNA GAS5、ZEB1的表达及其临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染孕妇血清长链非编码RNA GAS5(LncRNA GAS5)、锌指蛋白1(ZEB1)的表达及其临床意义。方法收集2017年6月1日-2018年10月30日HBV感染孕妇90例作为研究对象,根据新生儿脐血检测结果将其分为HBV宫内感染组40例与未感染组50例,选取同期分娩的非HBV感染的孕妇55例作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清GAS5、ZEB1 mRNA的表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素21(IL-21)水平;采用ELISA法检测血清白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素18(IL-18)水平;应用流式细胞仪检测Toll样受体4(TLR4)水平;采用Pearson法分析HBV宫内感染孕妇GAS5、ZEB1与IL-10、IL-17、IL-21、IL-12、IL-18、TLR4的相关性;采用Logistic多元回归分析影响HBV宫内感染的相关因素。结果与对照组相比,未感染组与宫内感染组孕妇血清GAS5的表达水平显著降低,ZEB1 mRNA的表达水平显著升高,IL-10、IL-17、IL-21水平显著升高,IL-12、IL-18、TLR4水平显著降低,未感染组与宫内感染组相比差异有统计学意义;GAS5与ZEB、IL-10、IL-17、IL-21呈负相关,ZEB1与IL-10、IL-17、IL-21呈正相关;GAS5与IL-12、IL-18、TLR4呈正相关,ZEB1与IL-12、IL-18、TLR4呈负相关;Logistic多因素分析显示GAS5、ZEB1是影响HBV宫内感染的独立危险因素。结论GAS5的表达水平降低与ZEB1的表达水平升高可能是HBV宫内感染的危险因素。

芪黄健脾滋肾颗粒对肾小球系膜细胞过度增殖的改善作用

目的:探讨芪黄健脾滋肾颗粒改善肾小球系膜细胞增殖的作用及其可能机制。方法:以体外培养的HBZY-1肾小球系膜细胞为模型,模型组采用TGF-β1刺激模拟肾小球系膜细胞过度增殖,血清组在模型组基础上加入芪黄健脾滋肾颗粒含药血清;采用CCK-8法检测肾小球系膜细胞的增殖活力;运用RT-PCR技术检测LncRNA GAS5、miR-21-5p、Sprouty1 mRNA、ERK1/2 mRNA的表达;采用Western blot法检测Sprouty1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达;结果:含药血清在10%浓度下对模型组的异常细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01);与正常组比较,模型组的ERK1、ERK2 mRNA和磷酸化蛋白及miR-21-5p表达水平均显著升高(P<0.01),GAS5和Sprouty1mRNA的表达则显著降低(P<0.01);与模型组比较,血清组可显著降低ERK1、ERK2 mRNA和磷酸化蛋白及miR-21-5p的表达(P<0.01),以及显著增加GAS5和Sprouty1 mRNA的表达(P<0.01)。结论:芪黄健脾滋肾颗粒可通过上调GAS5的表达,结合mi R-21、增加Sprouty1的表达,降低下游ERK1/2的表达,从而改善肾小球系膜细胞增殖。