lncRNA MIR4435-2HG靶向miR-376a-3p调控胆管癌细胞生物学行为的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)MIR4435-2HG(MIR4435-2HG)对胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其对微小RNA-376a-3p(miR-376a-3p)的调控作用。方法 qRT-PCR法检测人肝内胆管上皮细胞HIBEpic与人胆管癌细胞RBE中MIR4435-2HG、miR-376a-3p的表达。将si-NC、si-MIR4435-2HG、miR-NC、miR-376a-3p mimics、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-NC、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-376a-3p分别转染至RBE细胞,作为si-NC组、si-MIR4435-2HG组、miR-NC组、miR-376a-3p组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组;采用MTT法、Transwell小室法及流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验验证MIR4435-2HG与miR-376a-3p的靶向关系。Western blot检测相关蛋白表达。结果 RBE细胞中MIR4435-2HG表达量升高(P<0.05),miR-376a-3p表达量降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-MIR4435-2HG组MIR4435-2HG表达、细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率升高(P<0.05)。MIR4435-2HG可靶向调控miR-376a-3p;与si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组比较,si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(P<0.05),迁移及侵袭细胞数增多(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论 敲低MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-376a-3p进而抑制RBE细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导其凋亡。

MIR4435-2HG对胰腺癌预后和免疫浸润的评估价值

目的:探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG在胰腺癌预后以及免疫浸润中的评估价值。方法:胰腺癌患者的基因表达谱及临床资料从TCGA数据库和GTEx数据库中获得。比较胰腺癌和正常胰腺组织中MIR4435-2HG的表达水平,使用Wilcoxon秩和检验。MIR4435-2HG表达与免疫细胞的相关性使用Spearman相关性分析,MIR4435-2HG高表达和低表达免疫浸润水平的差异使用Wilcoxon rank-sum检验。通过生存分析及Cox回归分析确定MIR4435-2HG的预后价值,并构建列线图预测胰腺癌总生存率。结果:MIR4435-2HG在胰腺癌中高表达,MIR4435-2HG高表达患者总体生存率和无病生存率劣于低表达患者(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示N分期、病理分期、组织学分期、放射治疗、TSPAN6和Clorf112表达水平是胰腺癌患者总体生存率的独立影响因素(P<0.05)。MIR4435-2HG高表达与自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞和Th1细胞的免疫浸润水平呈正相关。结论:MIR4435-2HG可能是一种新的胰腺癌预后生物标志物。

长链非编码RNA MIR4435-2HG靶向微小RNA-1-3p调控信号通路磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)通过调控微小RNA-1-3p(miR-1-3p)的表达对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养正常胰腺细胞系hTERT-HPNE与胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3,将胰腺癌PaTu8988细胞按照随机数字表法分为si-MIR4435-2HG组(转染MIR4435-2HG siRNA)、si-con组(转染siRNA Control)、miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、miR-con组(转染miR-1-3p阴性对照)、si-MIR4435-2HG+an⁃ti-miR-1-3p组(共转染MIR4435-2HG siRNA与miR-1-3p抑制剂)、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con组(共转染MIR4435-2HG siR⁃NA与miR-1-3p抑制剂的阴性对照),同时将未经任何处理的细胞作为NC组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测细胞中MIR4435-2HG与miR-1-3p的表达;双荧光素酶报告基因检测MIR4435-2HG与miR-1-3p的相互作用。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析敲低MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞增殖的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白的表达。结果MIR4435-2HG在胰腺癌细胞中的表达水平明显高于正常胰腺细胞;MIR4435-2HG可特异性结合miR-1-3p并调控其表达活性;敲低MIR4435-2HG与上调miR-1-3p表达后,可抑制胰腺癌PaTu8988细胞增殖,明显减弱细胞迁移及侵袭能力[其中NC组、miR-con组、si-MIR4435-2HG组增殖活性分别为48 h:(1.21±0.10)、(1.18±0.12)、(0.86±0.09),细胞迁移数量分别为(90.56±9.16)、(88.56±8.91)、(26.49±2.10),细胞侵袭数量分别为(160.79±16.12)、(155.09±15.49)、(69.23±7.10),均P<0.05],下调PaTu8988细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9、p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的表达;抑制miR-1-3p表达可促进胰腺癌PaTu8988细胞增殖、迁移及侵袭。结论敲低LncRNA MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-1-3p表达并抑制PI3K/Akt信号通路活化而降低细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达,进而减弱胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

LncRNA MIR4435-2HG在HCT-116细胞株的顺铂耐药中的作用机制

目的探讨LncRNA MIR4435-2HG在HCT-116R细胞株的顺铂耐药中的作用机制。方法通过结肠癌细胞株HCT-116,建立顺铂耐药细胞株HCT-116R,进行细胞增殖试验,细胞株分别与加或不加25μm顺铂在McCoy's 5A培养基中培养24 h,通过RNA分离和实时荧光定量PCR分析,并测定Caspase-3活性。结果顺铂耐药细胞株HCT-116R中LncRNA MIR4435-2HG水平显著增加,在耐药细胞株HCT-116R中敲除MIR4435-2HG基因可显著恢复对顺铂的敏感性,抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。此外,mRNA水平中作为氧化应激途径的关键分子Nrf2和HO-1,被靶向MIR4435-2HG中的siRNA抑制,通过Nrf2/HO-1途径显示,MIR4435-2HG介导了顺铂耐药性。结论LncRNA MIR4435-2HG是可以驱动HCT-116的顺铂耐药性的主要因素。

lncRNA MIR4435-2HG通过靶向miR-873-5p调控小儿神经母细胞瘤细胞生物学功能

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)MIR4435-2HG通过靶向调控miR-873-5p影响小儿神经母细胞瘤细胞生物学功能的作用。方法:RT-qPCR检测神经母细胞瘤组织和细胞中lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表达。在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中转染si-MIR4435-2HG,MTT和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved PARP)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达,生物学信息预测与双荧光素酶报告实验验证MIR4435-2HG和miR-873-5p的靶向关系。在SK-N-SH细胞中转染miR-873-5p,观察其在细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭中的作用。si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p共转染干扰miR-873-5p对沉默MIR4435-2HG诱导的SK-N-SH细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:神经母细胞瘤组织和细胞中MIR4435-2HG表达明显上升,miR-873-5p表达显著下降(P<0.05)。沉默MIR4435-2HG可明显降低SK-N-SH细胞存活率、迁移数、侵袭数、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表达,显著提高细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白水平(P<0.05)。MIR4435-2HG靶向调控miR-873-5p表达。转染miR-873-5p可抑制SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭、Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达并诱导细胞凋亡,上调Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达。干扰miR-873-5p可部分逆转沉默MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。结论:lncRNA MIR4435-2HG通过靶向miR-873-5p调控神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。

FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2联合诊断胃癌的临床价值及机制研究

目的:筛选胃癌中差异性表达的长链非编码RNA(lncRNA),探讨代表性lncRNA在胃癌诊断中的潜在价值及相关机制。方法:从TCGA数据库中筛选在胃癌中差异性表达的lncRNA,通过GSE179252和GSE184336数据集以及qRT-PCR检测胃癌患者血清中lncRNA的表达水平对结果进行验证。绘制ROC曲线评价代表性lncRNA单独及联合检测的诊断效能。分析HOXC-AS2与胃癌患者临床病理参数的相关性。利用在线数据库对HOXC-AS2进行下游靶基因预测以及PPI蛋白互作分析,构建HOXC-AS2-miRNA-mRNA调控网络。结果:从TCGA数据库中筛选出3个在胃癌中差异性表达的lncRNA。TCGA-STAD、GSE179252和GSE184336数据集中FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2联合检测胃癌的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.994、0.958和0.921。血清中检测结果发现与胃良性疾病患者相比,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2在胃癌患者血清中表达升高(P<0.001),三者联合检测诊断胃癌的AUC为0.843,灵敏度和特异度分别为80%和86%。HOXC-AS2与胃癌肿瘤分级有相关性(P<0.05)。HOXC-AS2可与下游mRNA竞争miR-9-5p等miRNA结合位点,调控DLX6与HOXC蛋白家族之间的相互作用。结论:FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2的联合检测可用作胃癌的诊断标志物,HOXC-AS2可作为ceRNA促进胃癌进展。

MIR4435-2HG、miR-128-3p在膀胱尿路上皮癌中的表达及其相关性

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG与miR-128-3p在膀胱尿路上皮癌中的表达意义及相关性。方法采用实时荧光定量PCR检测87例膀胱尿路上皮癌组织及癌旁正常组织MIR4435-2HG和miR-128-3p的表达,将患者分别分为MIR4435-2HG高表达组(44例)、MIR4435-2HG低表达组(43例)或miR-128-3p高表达组(39例)、miR-128-3p低表达组(48例);比较两组间病理资料和预后生存差异;分析MIR4435-2HG和miR-128-3p表达的相关性。结果膀胱尿路上皮癌组织中MIR4435-2HG表达水平明显高于癌旁组织,而miR-128-3p表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05),且MIR4435-2HG和miR-128-3p表达呈负相关(r=-0.544,P<0.05)。MIR4435-2HG低表达和高表达组在病理分级、临床分期和淋巴结转移方面有统计学差异(P<0.05),而miR-128-3p低表达和高表达组各资料均无统计学差异(P>0.05);MIR4435-2HG高表达患者生存率低于MIR4435-2HG低表达组,而miR-128-3p高表达患者总生存率高于miR-128-3p低表达组(P<0.05)。MIR4435-2HG高表达和miR-128-3p低表达是影响膀胱尿路上皮癌患者预后的独立危险因素。结论膀胱尿路上皮癌组织MIR4435-2HG表达上调,miR-128-3p表达下调,两者均是患者预后不良的危险因素。

lncRNA MIR4435-2HG的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系。方法选取2019年1~12月手术切除的脑胶质瘤组织110例和颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织20例(对照组)。采用实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR检测组织和血清MIR4435-2HG水平及甲基化状态。结果110例胶质瘤中,低级别胶质瘤(WHO分级Ⅰ~Ⅱ级)65例,高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ~Ⅳ级)55例;IDH1突变46例。脑胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG表达水平均明显高于对照组(P<0.05),而甲基化率明显低于对照组(P<0.05)。低级别胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平明显低于高级别胶质瘤(P<0.05),而甲基化率明显高于高级别胶质瘤(P<0.05)。IDH1突变型胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平明显低于IDH1野生型(P<0.05),而甲基化率明显高于IDH1野生型(P<0.05)。MIR4435-2HG甲基化组胶质瘤组织和血清MIR4435-2HG水平明显低于非甲基化组(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清MIR4435-2HG水平鉴别脑胶质瘤级别的曲线下面积为0.752(95%置信区间0.701~0.804),最佳截断值为1.98,灵敏度和特异度分别为65.0%和91.5%。结论脑胶质瘤,尤其是高级别胶质瘤,血清MIR4435-2HG表达水平普遍升高,检测血清MIR4435-2HG水平有助于鉴别诊断脑胶质瘤级别。MIR4435-2HG转录受其基因甲基化水平的调控,并且与IDH1突变有关。

LncRNA MIR4435-2HG调控miR-138-5p/HMGA1轴对胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨LncRNA MIR4435-2HG对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及作用机制。方法培养正常人胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞系AGS、SGC7901、BGC823和BGC803,AGS细胞分为对照组(正常培养细胞)、si-con组(转染乱序无意义阴性序列)、si-MIR4435-2HG组(转染MIR4435-2HG小干扰RNA)、miR-con组(转染模拟物对照序列)、miR-138-5p组(转染miR-138-5p模拟物)、si-HMGA1组(转染HMGA1小干扰RNA)、si-MIR4435-2HG+pcDNA组(共转染MIR4435-2HG小干扰RNA与空载体)和si-MIR4435-2HG+pcDNA-HMGA1组(共转染MIR4435-2HG小干扰RNA与HMGA1过表达载体)。qRT-PCR检测细胞中MIR4435-2HG和高迁移率族蛋白A1(HMGA1)mRNA表达,Western blot检测细胞中HMGA1蛋白表达。双荧光素酶实验验证AGS细胞中MIR4435-2HG与miR-138-5p以及miR-138-5p与HMGA1之间关系。MTT检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测Ki67、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达。裸鼠分为对照组(接种正常培养的AGS细胞)、sh-MIR4435-2HG组(接种转染携带MIR4435-2HG基因短发夹RNA慢病毒的AGS细胞)和sh-con组(接种转染携带无关序列片段shRNA慢病毒的AGS细胞),接种21 d后测量肿瘤重量,观察MIR4435-2HG对裸鼠移植瘤生长的影响。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果与GES-1细胞比较,胃癌细胞AGS、SGC7901、BGC823、BGC803中MIR4435-2HG表达水平升高,HMGA1 mRNA和蛋白表达水平升高(P均<0.05),选择AGS细胞进行后续实验。MIR4435-2HG靶向负调控miR-138-5p表达,miR-138-5p靶向负调控HMGA1表达。与si-con组比较,si-MIR4435-2HG组AGS细胞48 h OD值(1.13±0.12比0.86±0.09)、迁移数量[(179.23±18.01)个比(60.15±6.05)个]、侵袭数量[(81.26±8.16)个比(25.64±2.59)个]、Ki67、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达水平均降低(P均<0.05)。与miR-con组比较,miR-138-5p组AGS细胞48 h OD值(1.28±0.13比0.85±0.09)、迁移数量[(178.26±17.59)个比(69.35±6.34)个]、侵袭数量[(81.02±8.06)个比(36.76±2.49)个]、Ki67、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达水平均降低(P均<0.05)。与si-con组比较,si-HMGA1组AGS细胞48 h OD值(1.28±0.13比0.83±0.09)、迁移数量[(175.62±17.59)个比(63.26±6.34)个]、侵袭数量[(80.16±8.06)个比(24.56±2.49)个]、Ki67蛋白表达水平(0.84±0.09比0.30±0.03),CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达水平均降低(P均<0.05)。与si-MIR4435-2HG+pcDNA组比较,si-MIR4435-2HG+pcDNA-HMGA1组AGS细胞48 h OD值(0.80±0.09比1.01±0.11)、迁移数量[(60.45±5.79)个比(119.25±12.46)个]、侵袭数量[(23.46±2.34)个比(59.46±6.29)个]、Ki67、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达水平均升高(P均<0.05)。与sh-con组比较,sh-MIR4435-2HG组裸鼠体内移植瘤重量[(0.40±0.03)g比(0.13±0.03)g]降低(P<0.05)。结论MIR4435-2HG在胃癌细胞系中高表达,沉默MIR4435-2HG表达可能通过调控miR-138-5p/HMGA1轴抑制胃癌细胞体外增殖、迁移和侵袭,并抑制体内肿瘤生长。

LncRNA MIR4435-2HG靶向TGF-β1对NSCLC细胞的影响

[目的]探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)靶向上调转化生长因子-β1(TGF-β1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、增殖的作用及其初步机制。[方法]检测NSCLC癌组织及其癌旁组织、NSCLC细胞株及正常人支气管上皮细胞(HBE)中MIR4435-2HG和TGF-β1表达。将pcDNA-MIR4435-2HG和pcDNA质粒转染至A549细胞,CCK-8法、Transwell法检测细胞增殖、迁移能力。Western Blot法检测细胞TGF-β1表达。免疫共沉淀验证MIR4435-2HG与TGF-β1靶向作用。[结果]NSCLC组织MIR4435-2HG(1.89±0.52 vs 0.76±0.48)和TGF-β1相对表达量(1.43±0.22 vs 0.37±0.18)均高于癌旁组织(P<0.05);与HBE细胞比较,NSCLC细胞株MIR4435-2HG相对表达量升高(P<0.05),且其中A549细胞高于H226细胞(P<0.05);与阴性对照组比较,MIR4435-2HG过表达组细胞MIR4435-2HG(4.72±0.43 vs 3.38±0.46)及TGF-β1(0.82±0.13 vs 1.07±0.24)相对表达量、细胞48 h OD值(0.43±0.03 vs 0.52±0.04)及迁移数量[(89.63±18.28)个vs(169.89±20.34)个]均增加(P<0.05),而与对照组比较,TGF-β1组细胞MIR4435-2HG表达未见显著变化(P>0.05)。[结论] NSCLC组织中MIR4435-2HG呈高表达,LncRNA MIR4435-2HG可能通过靶向上调TGF-β1促进NSCLC细胞迁移和增殖。