大黄酸对LoVo细胞水通道蛋白4表达的调节效应

目的:探讨大黄酸对体外培养LoVo细胞水通道蛋白4(AQP4)的调节效应。方法:体外培养LoVo细胞并予不同浓度大黄酸含药培养液处理24 h及大黄酸含药培养液(20 mg/L)处理不同时间,其中不同浓度分为大黄酸高(40 mg/L)、中(20 mg/L)、低(10 mg/L)剂量组和正常对照组;不同作用时间分为3、6、12、24、48 h组和正常对照组。采用免疫细胞化学方法观察LoVo细胞AQP4蛋白表达定位,采用Western blotting及半定量RT-PCR检测AQP4蛋白及mRNA的表达。结果:AQP4主要表达于LoVo细胞的细胞膜上,在细胞浆也有少量表达。随着大黄酸用药剂量增加,AQP4表达持续下降;大黄酸低剂量组与正常对照组比较,AQP4表达下降但无显著性差异;大黄酸中、高剂量组,AQP4表达则呈显著性下降。在时间效应方面,大黄酸3、6 h组AQP4表达无显著性下降,但在12、24、48 h组则显著下降;同时研究发现,AQP4表达下降的程度与大黄酸剂量及大黄酸作用时间均存在相关性。结论:大黄酸可抑制LoVo细胞AQP4基因转录与翻译,提示大黄酸对AQP4表达的调节可能与大黄的泻下作用有关。

大黄素对LoVo细胞水通道蛋白2表达的调节效应

目的探讨大黄素对体外培养LoVo细胞水通道蛋白2(aquaporin 2,AQP2)表达的调节效应。方法体外培养LoVo细胞并予不同质量浓度大黄素含药培养液24 h处理及大黄素含药培养液(20 mg/L)不同时间处理,采用免疫细胞化学方法观察LoVo细胞AQP2蛋白表达位置并初步观察AQP2蛋白表达的变化趋势,采用Western blotting及半定量RT-PCR检测AQP2蛋白及mRNA的表达。结果AQP2表达于LoVo细胞的细胞膜,且与大黄素用药浓度及用药时间存在着相关性。进一步的Western blotting证实,不同质量浓度大黄素含药培养液均可抑制AQP2蛋白的表达,药物质量浓度愈大,AQP2蛋白的表达愈低,其中大黄素20 mg/L组及40 mg/L组AQP2蛋白表达显著性降低;大黄素作用3、6 h组,AQP2蛋白表达上升,但与对照组比较,无显著差异;作用12、24、48 h组,AQP2蛋白表达呈进行性下降趋势。半定量RT-PCR结果显示,随着大黄素质量浓度的增加,AQP2 mRNA表达呈进行性下降趋势;在时间-效应方面,随着用药时间的延长,AQP2 mRNA表达呈进行性下降趋势。结论大黄素可抑制LoVo细胞AQP2基因转录与翻译,这提示大黄素对AQP2表达的调节效应可能与大黄的泻下作用有关。

钩吻素子体外诱导人结肠腺癌LoVo细胞凋亡的实验研究

目的探讨钩吻素子(Kou)体外能否诱导LoVo细胞凋亡。方法以Kou(50 μmol/L)作用于LoVo细胞,经光镜、电镜和荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并用流式细胞仪检测细胞增殖周期状态。结果通过光镜、电镜和荧光显微镜观察均证实Kou可诱导LoVo细胞凋亡,且凋亡百分率随Kou作用时间的延长而升高。经Kou作用后的肿瘤细胞,细胞周期状态发生明显变化,G0/G1期细胞从31.3%上升到42.3%,S期细胞从62.0%下降到38.7%。结论Kou可诱导LoVo细胞凋亡,且存在时间依赖关系,Kou可抑制细胞DNA的合成,阻止细胞由G1期向S期转化。

大蒜素对结肠癌LoVo细胞增殖的影响

目的:观察大蒜素对结肠癌细胞LoVo生长、细胞凋亡及细胞周期的影响。方法:不同浓度的大蒜素作用于体外培养的LoVo细胞,倒置显微镜下观察LoVo细胞的形态学变化,采用MTT法检测大蒜素对LoVo细胞增殖抑制能力,An-nexinV-FITC标记流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞的凋亡抑制率,流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞周期影响。结果:大蒜素可抑制人结肠癌LoVo细胞增殖,具有明显量效和时间依赖性,24、48和72h大蒜素抑制LoVo细胞的IC50分别为32.23、10.74和6.58μg/ml;大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,作用24h其诱导凋亡率随着药物浓度的递增具有增高趋势,作用48h其诱导凋亡作用峰值浓度为8μg/ml,后再继续增加浓度凋亡率反而下降;大蒜素作用LoVo细胞24h后,大蒜素浓度低于4μg/ml时,LoVo细胞周期被阻滞于G2/M;而高于4μg/ml时,细胞周期被阻滞于G2/M和G1期。结论:大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞增殖。

重组苦瓜MAP30蛋白对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响

目的:克隆及重组苦瓜蛋白MAP30,观察MAP30对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响。方法:RT-PCR法克隆MAP30基因的cDNA序列,并表达、纯化MAP30蛋白;MTT法测定纯化的MAP30蛋白对LoVo细胞的生长抑制作用;彗星实验观察MAP30引起凋亡的LoVo细胞基因组的降解情况。结果:成功克隆了苦瓜蛋白MAP30基因;MAP30蛋白对LoVo细胞体外生长具有抑制作用;MAP30蛋白对LoVo细胞半数抑制质量浓度(IC50)为70.0mg/L。MAP30在体外能诱导LoVo细胞凋亡。结论:重组的苦瓜MAP30蛋白在体外能抑制LoVo细胞生长,并能诱导其凋亡。

三氧化二砷诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的细胞生物学研究

目的 :观察三氧化二砷 (As2 O3 )对结肠癌LoVo细胞体外生长的影响。方法 :选用不同剂量As2 O3 处理LoVo细胞后 ,通过光镜、电镜、MTT法、AO/EB荧光染色法和流式细胞术研究As2 O3 对LoVo细胞生长的影响。结果 :As2 O3 具有抑制Lo Vo细胞生长和其凋亡的作用 ,这种作用主要在低浓度 (0 5～ 2 0 μmol/L)产生 ,而在高浓度 (5 0～ 10 0 μmol/L)可引起细胞死亡。结论 :As2 O3 有明显抑制LoVo细胞生长的作用 ,并诱导细胞凋亡 ,其作用机制尚不清楚。

齐墩果酸诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡作用研究

目的研究齐墩果酸（oleanolic acid,OA）诱导人结肠癌LoVo细胞株凋亡的机制。方法应用浓度为2.00~32.00 mg.L-1OA作用于人结肠癌LoVo细胞12~96 h后,采用噻唑蓝（MTT）法检测OA对LoVo细胞的抑制作用,采用流式细胞术、Western blot印迹法等检测细胞周期变化、凋亡及Bcl-2、Bax、p53、Caspase-3蛋白表达,在光镜及电镜下观察细胞形态学变化。结果 OA呈时间-剂量依赖性抑制LoVo细胞增殖,能诱导LoVo细胞凋亡及阻滞细胞于G2/M期,OA作用LoVo细胞48 h后,各组的细胞凋亡率为10.32%~14.24%（P〈0.05）,并出现Bcl-2蛋白表达抑制,p53、Bax及Caspase-3活性增强。结论 OA可以促进人结肠癌LoVo细胞凋亡,其促凋亡机制与抑制Bcl-2表达及促进p53、Bax及Caspase-3表达有关。

LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用

目的研究LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用。方法用XTT检测LHRH-PE40对LOVO细胞的体外细胞毒性。将LOVO细胞移植于裸鼠,测定静脉注射LHRH-PE40对体内肿瘤细胞生长的抑制作用。结果LHRH-PE40对LOVO细胞细胞毒作用的半数抑制浓度为2·103μg/ml,在裸鼠肿瘤模型中,LHRH-PE40剂量为150μg/kg时抑瘤率为68·49%,这种细胞毒性作用可以被LHRH(或LHRH类似物)特异性抑制。结论在体内外LHRH-PE40对LOVO细胞具有很强的细胞毒作用,其机制是LHRH-PE40通过与癌细胞膜上的LHRH受体特异结合发挥细胞杀伤作用。

天花粉蛋白基因的克隆及其诱导大肠癌细胞LoVo凋亡的作用

目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)基因及研究重组TCS诱发大肠癌细胞LoVo凋亡的作用。方法RT-PCR法克隆TCS基因的cDNA序列并表达纯化TCS;MTT法测定TCS对LoVo细胞生长抑制作用,评估TCS体外诱导LoVo凋亡的作用;琼脂糖凝胶电泳法进行细胞凋亡DNA分析。结果成功克隆了TCS基因,TCS对LoVo细胞体外生长具有抑制作用,DNA电泳呈梯状条带,表明TCS对LoVo细胞确实存在诱导凋亡作用,TCS对LoVo细胞半数抑制浓度(IC50)为45.0μg/mL。结论TCS体外能抑制LoVo细胞生长并诱导细胞凋亡,为今后TCS应用于大肠癌的临床治疗提供了重要的实验依据。

放线菌酮和TNFα协同诱导Lovo细胞凋亡

目的探索放线菌酮和ＴＮＦα协同诱导人大肠癌Ｌｏｖｏ细胞凋亡的发生规律．方法用细胞体外培养方法，以放线菌酮和ＴＮＦα均小剂量作用于人大肠癌Ｌｏｖｏ细胞，经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８荧光染色，光镜观察形态改变，并用流式细胞术检测ＤＮＡ断裂情况．结果单用ＴＮＦα５×１０５Ｕ／Ｌ或放线菌酮４ｍｇ／Ｌ，均未引起Ｌｏｖｏ细胞凋亡效应．而两者协同，随作用１２ｈ～４８ｈ，Ｌｏｖｏ细胞渐出现明显的凋亡形态学改变和ＤＮＡ断裂．结论小剂量的放线菌酮和ＴＮＦα协同作用于人大肠癌Ｌｏｖｏ细胞，出现明显的凋亡效应．

复方五味子素B逆转人结肠癌细胞THC-8307/OXA多药耐药性机制研究

目的研究复方五味子素B对耐奥沙利铂人结肠癌细胞(TH C-8307/O X A)多药耐药性的逆转作用及其机制。方法采用噻唑蓝(M TT)比色法检测奥沙利铂(O X A)和复方五味子素B(γSC)的细胞毒性;碱性磷酸酶免疫组织化学法和W estern blot检测γSC对TH C-8307/O X A细胞G ST-п蛋白水平的影响。结果γSC(6.0、12.5和25.0μg/m L)对人结肠癌细胞(TH C-8307)和耐奥沙利铂人结肠癌细胞(TH C-8307/O XA)无显著毒性作用(P>0.05),O X A对TH C-8307的IC 50为0.06μg/m L,而对TH C-8307/O X A的IC 50为2.32μg/m L,TH C-8307/O X A是TH C-8307对O X A耐药的39倍,γSC(6.0、12.5和25.0μg/m L)能使O X A对TH C-8307/O X A细胞的IC 50从2.32μg/m L依次下降至0.370、0.128和0.057μg/m L,逆转倍数分别为6.2、18.1和40.7倍。碱性磷酸酶免疫组织化学法和W estern blot检测γSC(12.5μg/m L)处理48 h后,TH C-8307/O X A细胞G ST-п蛋白表达明显降低。结论γSC具有逆转耐奥沙利铂人结肠癌细胞的M D R作用,其作用机制与下调G ST-п表达有关。

犀黄丸对大肠癌LoVo细胞基质金属蛋白酶2,9蛋白表达的影响

[目的]研究犀黄丸含药血清对大肠癌LoVo细胞中基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,MMP-9)表达的影响及意义。[方法]应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测犀黄丸含药血清作用下LoVo细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。[结果]在犀黄丸含药血清的干预下,LoVo细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白分泌水平与空白对照组比较明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]犀黄丸可能通过抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表达,达到抑制大肠癌转移的作用。

enmein、serrin B、nodosin和lasiodonin对HL60细胞株和LOVO细胞株的增殖抑制作用

目的研究enmein、serrin B、nodosin和lasiodonin对HL60细胞株和LOVO细胞株的增殖抑制活性。方法应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选enmein、serrin B、nodosin和lasiodonin对HL60细胞株和LOVO细胞株的细胞毒活性。结果enmein、serrin B、nodosin和lasiodonin对HL60细胞株和LOVO细胞株都有一定程度的抑制作用,其抑制活性呈现剂量-效应关系,其中以serrin B和nodosin效果较为显著。结论enmein、serrin B、nodosin和lasiodonin是中药溪黄草拮抗白血病和结肠癌的有效成分,溪黄草具有一定的防治白血病和结肠癌的作用。

反义DLC-1基因对结直肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

目的应用核糖核酸干扰(RNAi)技术,通过对大肠癌细胞株LoVo中DLC-1基因mRNA表达的抑制,初步探讨DLC-1基因对大肠癌细胞株的生物学行为影响。方法构建DCL-1的RNAi重组体pGCsiDLC,转染大肠癌LoVo细胞株。采用RT-PCR观察转染前后细胞株中DLC-1 mRNA以及Bax、Bcl-2基因表达的改变,MTT比色法检测转染前后细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建发卡siRNA真核表达载体pGCsiDLC;pGCsiDLC转染LoVo细胞后,电泳显示DLC-1 mRNA表达水平明显下降;LoVo细胞生长曲线增长幅度亦随时间的增加而逐渐增高,在48h最为明显,RNAi组细胞比脂质体组及空白对照组细胞增殖明显增高(P<0.05);干扰后的LoVo细胞株G0/G1期发生阻滞,而G2/M期细胞数量分布减少。而Bax和bcl-2基因表达在干扰前后未见明显改变。结论成功构建载体介导的DLC-1靶向RNAi重组体可有效抑制LoVo细胞DLC-1 mRNA表达;DLC-1基因可抑制结直肠癌细胞增殖并且对细胞周期重新分布,其可能与结直肠癌的发生发展有一定关系,可能是一个新的抑癌基因。

siRNA特异性沉默septin2基因抑制大肠癌LoVo细胞迁移

目的:检测新型骨架蛋白septin 2在不同转移能力的人结直肠癌细胞株中的表达水平,探究其在结直肠癌细胞迁移中的作用。方法:采用实时荧光定量RT-PCR及Western blotting检测septin 2基因及其蛋白在高转移潜能细胞株LoVo和低转移潜能癌细胞株HT-29、SW480、HCT-116中的表达;用siRNA干扰方法沉默高表达的septin 2基因,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效率,免疫荧光共聚焦实验观测干扰前后septin 2蛋白表达的变化,划痕实验检测干扰前后细胞的迁移能力。结果:septin 2在LoVo细胞的表达水平显著高于HT-29、SW480及HCT-116细胞(P<0.05)。沉默septin 2基因后,LoVo细胞septin 2 mRNA表达降低(P<0.05);septin 2与纤维状肌动蛋白(F-actin)存在共表达;F-actin表达减弱,应力纤维减少,片状伪足细而短;细胞迁移能力减弱。结论:septin 2基因在LoVo细胞高表达,干扰其表达能导致细胞骨架重构,从而降低细胞迁移能力。

Akt shRNA载体的构建及其对结肠癌细胞株Lovo Akt基因表达的抑制作用

目的构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,通过RNAi下调Akt基因在结肠癌Lovo细胞系中的表达,观察对结肠癌细胞生长的影响。方法将靶向人Akt基因的两条shRNA(Akt1-U6-1#;Akt1-U6-2#)表达序列克隆到入门载体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后与目的表达载体Plentio/Block-iT DEST Vector进行LR位点特异性重组;分别将入门载体与目的表达载体转染入Lovo细胞,对细胞株行RT-PCR和Western blotting检测,观察siRNA对靶基因Akt的抑制效果。结果 DNA测序证实pENTRTM/U6-TF-shRNA入门载体和Plentio/Block-iT DEST目的表达载体为阳性克隆,转染Lovo细胞后,Akt基因在mRNA和蛋白水平的表达量受到明显抑制。结论成功构建了靶向人Akt的shRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Lovo细胞Akt基因表达,为进一步研究Akt的功能和肿瘤的基因治疗奠定了实验基础。

伊立替康、奥沙利铂及氟尿嘧啶对人大肠癌LoVo细胞株作用的实验研究

目的:研究国产盐酸伊立替康(CPT-11)、奥沙利铂(L-OHP)及氟尿嘧啶(5-FU)对人大肠癌细胞株LoVo的生长抑制作用。方法:采用MTT法观察上述药物单药应用、两药及三药同时或序贯联合应用对大肠癌LoVo细胞生长的影响,评价药物联合应用的效果。结果:单药应用、两药联合及三药联合应用均对大肠癌LoVo细胞有显著的抑制作用(P<0.05);两药联合应用均优于各自单药的抑制效果,CPT-11联合L-OHP弱于CPT-11或L-OHP与5-FU联合的抑制效果(P<0.05),由L-OHP到CPT-11小剂量序贯联合具有明显的协同作用;三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P<0.05),由5-FU+L-OHP到5-FU+CPT-11的序贯联合应用与三药同步联合应用无显著性差异(P>0.05),但由5-FU+CPT-11到5-FU+L-OHP序贯应用时明显低于三药同步应用的效果(P<0.05),且三药全量及半量联合应用效果差异无显著性(P>0.05)。结论:由5-FU+L-OHP到5-FU+CPT-11的小剂量序贯联合应用具有高效协同抑制大肠癌细胞株LoVo的作用,可为临床难治性和复发性大肠癌患者的化疗及小剂量序贯化疗提供参考。

23-羟基白桦酸诱导LoVo细胞凋亡与线粒体膜电位的变化

目的探讨23-羟基白桦酸对人结肠癌细胞株LoVo细胞增殖和凋亡的影响。方法采用MTT法检测23-羟基白桦酸对LoVo细胞的增殖抑制作用。Hoechst染色、流式细胞仪检测细胞凋亡及线粒体膜电位的变化。结果23-羟基白桦酸能抑制LoVo细胞的增殖,其作用呈明显的时间和剂量依赖性。Hoechst33258染色显示细胞凋亡特征。23-羟基白桦酸25、50、100及200μmol·L-1作用LoVo细胞48h后,其凋亡率分别为11.32%±0.92%、19.23%±0.78%、24.51%±5.88%及42.22%±2.32%,显示一定的剂量依赖性关系。与空白组相比,23-羟基白桦酸可明显降低LoVo细胞线粒体膜电位(P<0.01)。结论23-羟基白桦酸可抑制LoVo细胞的增殖,其机制与降低线粒体膜电位继而诱导LoVo细胞凋亡有关。

大黄酚对LoVo细胞AQP2表达的调节效应

目的:探讨大黄酚对体外培养LoVo细胞AQP2表达的调节效应.方法:体外培养LoVo细胞,随机分为对照组,大黄酚10,20,40mg/L不同浓度组.间接免疫荧光定性LoVo细胞AQP2表达,WesternBlot、半定量RT-PCR检测药物处理24h后AQP2蛋白及mRNA表达.体外培养LoVo细胞后,随机又将细胞分为对照组,大黄酚40mg/L组,PKA激动剂8-Bromo-cAMP10mg/L组,大黄酚40mg/L+PKA激动剂8-Bro-mo-cAMP10mg/L组.非放射性法检测药物处理24h后LoVo细胞PKA的活性水平.结果:AQP2表达于LoVo细胞膜,药物处理24h后,大黄酚20,40mg/L组AQP2蛋白分别为(0.64±0.08),(0.46±0.09)显著低于对照组(0.83±0.05),(P<0.01);AQP2mRNA分别为(0.50±0.12),(0.39±0.09),显著低于对照组(0.73±0.08),(P<0.01).40mg/L大黄酚组PKA活性(0.54±0.08)显著低于对照组(0.78±0.10),(P<0.05).结论:大黄酚可抑制LoVo细胞AQP2基因转录与翻译.大黄酚对AQP2表达的调节效应可能与大黄泻下作用有关,其可能是通过PKA信号通路调节AQP2的表达.

紫外线诱导体外培养的LOVO、HT-29细胞的凋亡

目的研究紫外线照射体外培养的大肠癌ＬＯＶＯ和ＨＴ┐２９细胞后，诱导这两株大肠癌细胞系发生凋亡的作用。方法紫外线照射两株大肠癌细胞系后２４～３６ｈ，通过琼脂糖凝胶电泳、ＨＥ染色和流式细胞仪检测两株细胞发生凋亡的情况。结果两株大肠癌细胞在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂，琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带，流式细胞仪分别在２４和３６ｈ出现亚二倍体峰。结论紫外线具有杀灭癌细胞的作用，其机制与诱导细胞凋亡有关；其方法简单、易行，可作为研究细胞凋亡的较好的体外模型。