麦洼牦牛MFSD4A基因克隆及组织表达分析

旨在克隆麦洼牦牛MFSD4A基因序列并阐明其在不同组织中的表达模式,分析MFSD4A互作蛋白mRNA表达水平及其相关性,确定MFSD4A蛋白的亚细胞定位,为后续MFSD4A在牦牛睾丸生长发育调控研究中提供理论依据。以4头健康麦洼牦牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、臀肌、背部肌肉、睾丸、结肠组织作试验材料,用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛MFSD4A基因CDS序列并对其进行生物信息学分析;利用RT-qPCR技术检测MFSD4A基因在心、肝、脾、肺、肾、臀肌、背部肌肉、脂肪、睾丸、淋巴等10个组织中的表达及与其互作蛋白的相关性;构建pEGFP-MFSD4A融合质粒转染牛肾细胞系(MDBK)探究MFSD4A蛋白的亚细胞定位情况。结果表明,麦洼牦牛MFSD4A基因CDS区全长为1 530 bp,编码509个氨基酸,理论等电点(pI)为8.66,具有12个跨膜结构域,属于碱性跨膜蛋白;RT-qPCR结果显示,MFSD4A mRMA在麦洼牦牛各组织中差异表达,且在睾丸组织中表达量最高,与MFSD9、CBY1、INHBA、UNC93A、SVOP、ID1在睾丸组织中的表达量呈极显著正相关,推测MFSD4A基因可能与牦牛睾丸的生长发育调控有关;构建pEGFP-MFSD4A融合质粒转染牛肾细胞(MDBK)后的荧光定位显示该蛋白主要定位于细胞核。

牦牛GnIH基因生物学特征分析及其在卵巢颗粒细胞中亚细胞定位的研究

为探究促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)基因的序列特征及其在牦牛卵巢颗粒细胞中的表达与定位,试验从牦牛卵巢组织cDNA中克隆了GnIH基因,利用在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测GnIH基因在牦牛各器官中的表达情况,通过免疫组织化学和免疫荧光法检测GnIH在组织中的表达及定位。结果表明:GnIH基因编码序列(CDS)区大小为591 bp,编码196个氨基酸;牦牛GnIH基因与黄牛和野牦牛同源性最高;GnIH前体为不稳定亲水酸性蛋白,且无跨膜结构,在第26,27个氨基酸间有信号肽区域,同时GnIH前体包含了3个磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。GnIH基因在卵巢中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05);随着卵泡的增长发育,GnIH基因在卵泡颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,大卵泡(≥6 mm)中GnIH基因相对表达量最高,显著高于中(>3~<6 mm)、小卵泡(≤3 mm)(P<0.05),而中、小卵泡之间差异不显著(P>0.05)。GnIH在卵巢颗粒细胞的细胞核及细胞质中均有表达。说明牦牛GnIH基因参与了牦牛的卵泡发育调控。

绵羊夏伯特线虫对成年牦牛的致病作用及对局部黏膜免疫功能的影响

对自然感染绵羊夏伯特线虫的牦牛(感染组)进行了病理学观察,并同正常牦牛(对照组)进行了比较。结果显示,虫体寄生部位主要在大肠回盲口、盲肠以及结肠前约1/3处,寄生数量为30～50条。寄生部位黏膜增厚,呈脑回样增生,颜色灰白,偶见散在点状出血现象,表面附有较多黏液。黏膜上皮、固有层内肠腺及杯状细胞、浆细胞、弥散淋巴组织均有增生,固有层、黏膜肌层以及黏膜下层可见大量嗜酸性粒细胞浸润,黏膜下层淋巴小结、淋巴集结以及血管周围肥大细胞显著增生,偶见黏膜出血、黏膜上皮坏死脱落等变化。结果表明,肠黏膜脑回样病变实际是由宿主机体自身组织增生所致。成年牦牛对绵羊夏伯特线虫的抗感染能力较强,其原因可能是成年牦牛寄生部位的黏膜相关淋巴组织发育成熟完善,可通过增生加强局部免疫力来抵抗寄生虫的寄生。

成年牦牛感染扩展莫尼茨绦虫的局部免疫细胞学反应

为明确扩展莫尼茨绦虫感染成年牦牛所引起的免疫细胞学反应及致病作用,对感染牛的寄生部位进行了观察与研究,并同正常成年牦牛进行了比较。结果表明,扩展莫尼茨绦虫成虫仅寄生于牦牛的小肠。寄生部位的黏膜可见少量出血点,表面附有较多黏液,散在直径2-3 mm的溃疡灶,小肠黏膜集合淋巴小结较对照组发达,数量明显增多。光镜下可见小肠黏膜出血,部分黏膜上皮坏死、脱落,局部黏膜相关淋巴组织增生明显,黏膜层嗜酸性粒细胞大量浸润,浆细胞、杯状细胞和嗜银细胞显著增生,黏膜下层血管周围肥大细胞增多。非寄生部位的组织及器官无明显病变。扫描电镜结果显示寄生部位的肠绒毛断裂或脱落,圆顶区的数量较对照组多,圆顶区滤泡相关上皮中M细胞的数量也较对照组多。研究证实,扩展莫尼茨绦虫感染可引起成年牦牛感染部位强烈的免疫细胞学反应,表明成年牦牛肠道黏膜的抗感染能力较强,故寄生虫对其致病作用较弱。

不同月龄牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6的基因表达及蛋白质定位

为探讨人源类溶菌酶蛋白4(Human lysozyme-like protein4,LYZL4)和人源类溶菌酶蛋白6(Human lysozyme-like protein 6,LYZL6)在牦牛睾丸中的表达机制,分别选取6、18、30、72月龄健康的牦牛12头(每组3头)采集睾丸组织。应用qRT-PCR、Western-blot和免疫组化技术分别分析了LYZL4和LYZL6在不同月龄牦牛睾丸中的表达和定位。结果显示,在不同月龄牦牛睾丸中均检测到 LYZL4、LYZL 6 基因和相关蛋白质的表达,其基因表达量随着牦牛月龄增加呈现上升趋势。72、30月龄牦牛睾丸中 LYZL4、LYZL 6 基因及蛋白质的表达量极显著高于6月龄和18月龄牦牛( P < 0.01)。LYZL4蛋白在6月龄牦牛睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞和支持细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞内。而LYZL6蛋白在6月龄牦牛的睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞和初级精母细胞内。 LYZL4和LYZL 6 基因主要在牦牛性成熟后高丰度表达,而在性成熟前相对低丰度表达。因此,在牦牛雄性生殖系统的发育过程以及在精子发生的调控过程中LYZL4和LYZL6均发挥着重要的作用。

GPx5在牦牛隐睾附睾组织的分布特征及定位分析

【目的】研究谷胱甘肽过氧化物酶-5(glutathione peroxidase-5,GPx5)在成年牦牛隐睾及正常附睾组织的表达及分布特征,探索其对牦牛精子成熟及生殖机能的调节作用。【方法】选取4岁成年牦牛隐睾及正常附睾各8对,应用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫组织化学SP法、免疫组织荧光染色法及IPP图像分析研究GPx5的表达及分布特征。【结果】(1)牦牛正常组附睾上皮为假复层柱状纤毛上皮,管腔内有大量精子,管腔外围结缔组织丰富;隐睾组附睾组织趋向纤维化,间质内胶原纤维增生,无正常精子。(2)GPx5在牦牛正常组附睾头部和体部表达均显著高于隐睾组(P<0.05)。(3)GPx5在2组附睾基细胞、晕细胞、管周肌样细胞、静纤毛及血管内皮细胞均有不同程度表达,正常组附睾上皮主细胞GPx5呈强阳性表达,而隐睾组主细胞无阳性表达;正常组附睾头部和体部顶端细胞GPx5呈阳性表达,尾部顶端细胞GPx5则呈强阳性,隐睾组附睾头、体和尾顶端细胞GPx5均呈强阳性表达。【结论】高原低氧环境下,牦牛隐睾附睾趋向纤维化;隐睾附睾头及附睾体GPx5显著降低,且主要表现为主细胞及基细胞的表达缺失,提示其与精子氧化应激损伤及抗氧化调节密切相关。

九龙牦牛与本地牦牛杂交效果的分析

一九八六年我县引进九龙牦牛种公牛(40头)改良本地牦牛,F_1代生产性能和繁活率高于本地牦牛同期水平:F_1代成年公、母牛体重分别为210.5±75.8、190.2±13.7kg,本地牦牛同期相应为169.27±25.42、143.8±10.73kg,F_1代比本地提高24.4%、32.3%;F_1代成年公、母、阉牛毛绒产量分别为1.41±0.21、0.37±0.06、1.17±0.15kg,本地牦牛同期相应为1.27±0.34、0.30±0.40、1.03±0.27kg,F_1代比本地提高11.0%、23.3%、13.6%;F_1代86—89年平均繁活率为4.9%,本地牛同期相应为2.0%,F_1代比本地提高2.9个百分点。九龙牦牛改良本地牦牛有一定的杂交优势,提高了产肉性能。

青海省民和县马营镇牦牛寄生虫区系调查

采用寄生虫剖检法对民和县马营镇牦牛的寄生虫进行寄生虫种类和数量的调查,结果表明:发现线虫20种、绦虫1种、牛皮蝇1种、虱蝇1种。单体荷虫量达289条,普通奥斯特线虫(Ostertagia Cricumcincta)为优势虫种,感染率为100%,感染强度为104(11-180)。