整合REV-LTR基因的MDV活疫苗与亲本CVI988/Rispens株的免疫效力比较

利用同源重组技术将禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)整合进CVI988/Rispens疫苗株基因组中所构建成的重组马立克氏病病毒株(r MDV-LTR株),具有较高的增殖效率。为比较r MDV-LTR株与亲本CVI988/Rispens株的免疫效力差异,开展了对这两种疫苗的比较试验。试验将这两种疫苗分别按照三个不同剂量经颈背部皮下接种1日龄SPF鸡。接种后第7 d,攻毒马立克氏病强毒株rMd5,连续观察60 d后进行剖检。临床病理观察结果发现,以不低于250 PFU/羽剂量的rMDV-LTR株或CVI988/Rispens株免疫SPF雏鸡都可以提供大于80%的免疫保护效率;以125 PFU/羽剂量的两种疫苗虽均不能提供大于80%的免疫保护效力,但rMDV-LTR株免疫组试验鸡未出现死亡,仅有2只鸡出现消瘦,剖解脏器无肿瘤,而CVI988/Rispens株免疫组鸡出现2只死亡,其中1只剖解后检出肿瘤。rMDV-LTR株和CVI988/Rispens株免疫组的免疫保护指数分别为77.78%和66.67%。由实验结果可见,在较小免疫剂量下,rMDV-LTR株免疫保护率高于亲本CVI988/Rispens疫苗株。说明重组毒rMDV-LTR疫苗株可以作为一种安全的、有效的新型MDV疫苗。

免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的分析免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域(VISTA)、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2(HHLA2)在子宫内膜癌(EC)中的表达及临床意义。方法选取2017年9月至2019年10月唐山市妇幼保健院收治的120例的EC患者作为研究对象,收集其的EC组织和癌旁正常组织。检测EC组织和癌旁正常组织VISTA、HHLA2的表达;采用Spearman分析免疫检查点VISTA、HHLA2的相关性;Kaplan-Meier分析VISTA、HHLA2与预后的关系;Cox回归分析影响EC患者预后的危险因素。结果EC组织中VISTA、HHLA2阳性表达率显著高于正常癌旁组织(P<0.05)。Spearman相关性结果显示EC组织中VISTA与HHLA2表达呈正相关性(r=0.587,P<0.05)。EC组织中VISTA、HHLA2表达与临床病理特征有关(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线结果显示VISTA阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=11.864,P<0.05),HHLA2阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=4.975,P<0.05)。Cox回归分析结果显示VISTA和HHLA2是影响EC患者预后的危险因素(P<0.05)。结论免疫检查点VISTA、HHLA2在EC中高表达,其是影响EC预后的危险因素,二者可能是有价值的预后标志物。

植物LTR反转录转座子的研究进展

反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子,它们以RNA为媒介,在基因组中不断自我复制。在高等植物中,反转录转座子是基因组的重要成分之一。反转录转座子可以分为5大类型,其中以长末端重复(LTR)类型报道较多。LTR类型由于其首尾具有长末端重复序列,内部含有PBS、PPT、GAG和POL开放阅读框、TSD等结构,可以采用生物信息学软件进行预测。LTR反转录转座子的活性受到自身甲基化和环境因素的影响,DNA甲基化抑制反转录转座子转座,而外界环境的刺激能够激活转座子,从而影响插入位点周边基因的表达。同时由于LTR反转录转座子在植物中普遍存在,丰富的拷贝数以及多态性为新型分子标记(RBIP、SSAP、IRAP、REMAP)的开发提供了良好的素材。该文对近年来国内外有关植物反转录转座子的类型、结构特征、LTR反转录转座子的活性及其影响因素、LTR反转录转座子的预测以及标记开发等方面的研究进展进行综述。

禽内源性反转录病毒ALVE1LTR转录水平分析

本研究以禽内源性反转录病毒ALVE1为研究对象,分析了ALVE1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)自身转录的变化规律。荧光定量PCR结果显示LTR在2日龄SPF鸡(发育早期)器官组织中转录水平高,而在35日龄SPF鸡(发育晚期)器官组织中转录水平低。焦磷酸测序和荧光定量PCR关联分析发现,ALVE1 LTR在鸡巨噬细胞系HD11和鸡T淋巴细胞系MSB1细胞中的转录水平可能受DNA甲基化调控,去甲基化处理HD11或MSB1 24 h后,LTR转录水平显著增加。通过序列分析发现ALVE1 LTR高度保守且存在先天性免疫应答激活转录因子如NF-AT、c-JUN等。本研究揭示了ALVE1 LTR自身转录的变化规律,为进一步分析ALVE1 LTR功能奠定了基础。

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ，以其为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ，并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析，ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定，获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现，在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点，其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点，Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列；Ｒ区长为８１ｂｐ，含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ；在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点，即ＴＡＲ位点；Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比，在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生，中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。

罗田甜柿Ty1-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列的分离和特性分析

逆转座子序列信息的获得,对了解其在基因组中的行为及系统学研究有重要价值。本试验从罗田甜柿(Diospyros kaki Thunb.‘Luotian-tianshi’)基因组中分离出31个RNaseH-LTR(long terminal repeat,长末端重复)序列,并利用逆转座子间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)技术对部分序列相应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行初步探讨。序列分析结果表明,至少有10个Ty1-copia类逆转座子家族得到扩增;其家族间普遍表现高度异质,碱基替换、插入或缺失突变,以及翻译成氨基酸后发生不同程度的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等,是产生高异质性的原因;此外,其家族内部某些序列间的相似性极高,可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现。应用部分逆转座子引物的IRAP分析结果表明,相应的逆转座子家族在柿属植物中普遍存在,其分布广泛,拷贝数高,转座活性强,具有进一步开发为多种逆转座子分子标记的潜力。

cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long terminalrepeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG egfp和MFG egfp cmv表达载体。结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloneymurineleukemivirus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoRI和SacI之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphI和HindⅢ之间,构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达。本研究提示,REVLTR能够作为启动子构建表达质粒。

盐胁迫下棉花LTR-反转座子的转录激活及在耐盐相关基因发掘中的应用

LTR-反转座子是棉花基因组的主要组成部分,在基因组中通常呈现"静止"状态。但受到胁迫刺激时,部分反转座子的转录活性可被"激活",可能影响邻近基因的表达。本研究在盐胁迫下通过生物信息学手段,在旱地棉转录组数据库中检测到3 885个转录激活的候选LTR-反转座子;这些候选LTR-反转座子上下游5 kb内共有1 787个邻近基因,其中377个邻近基因在盐胁迫下差异表达,通过对377个基因进行功能注释发现,326个基因注释到GO数据库中,并且部分基因与棉花已报道过的耐盐抗旱基因同源。本研究结果将为棉花的耐盐分子机理解析提供一定的理论基础。

人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2在人食管胃交界腺癌组织中的表达

目的探索新型免疫检查点人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2(HHLA2)在人食管胃交界腺癌组织中的表达及其临床意义。方法选取2016年3月至2018年6月安阳市肿瘤医院收治的食管胃交界腺癌患者126例作为研究对象,采用免疫组化染色检测食管胃交界腺癌和癌旁正常组织中HHLA2表达,随访终点为患者死亡。采用COX回归风险模型进行多因素生存分析,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果HHLA2在食管胃交界腺癌组织中阳性表达率为68.9%(78/126),高于癌旁正常组织的21.1%(27/126)(χ^(2)=42.465,P<0.001)。多因素COX分析显示,TNM分期、HHLA2表达是患者总生存期的独立预后因素(HR=4.217,P<0.001;HR=2.467,P=0.003)。高表达HHLA2和低表达HHLA2的食管胃交界腺癌患者5 a生存率分别为24.4%和56.3%(χ^(2)=21.140,P<0.001)。结论HHLA2在食管胃交界腺癌组织中表达升高,且与患者总生存期存在相关性;高表达HHLA2和TNM分期进展是导致患者总生存期缩短的独立危险因素。

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株致弱过程中不同代次病毒LTR的进化分析

为揭示马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机理,本研究对EIAV弱毒疫苗株在体外驴白细胞传代过程中不同代次毒株的长末端重复序列(LTR)进行扩增和分析。结果显示:随着病毒在体外传代次数的增加,各病毒株遗传多样性逐渐增加,并与致弱前亲本株EIAVDV117的遗传距离逐渐增大;EIAV在体外传代过程中LTR的变异主要集中在U3区和R区的转录起始位点,但随着传代次数的增加,在负调节区丢失了GATA结合位点,并在增强子区出现了E-box基序。此外,传代初期低代次病毒株与后期的高代次弱毒株在负调节区的AP-1结合位点和转录起始位点以及TAR的起始位点存在明显差异。

牛泡沫病毒LTR的反式激活因子靶序列研究(英文)

牛泡沫病毒（ＢＦＶ）是反转录病毒科泡沫病毒属成员之一．其基因组除编码ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ三个结构基因外，在ｅｎｖ和３＇ＬＴＲ之间有２个ＯＲＦ（ＯＲＦ－１和ＯＲＦ－２），编码自身的反式激活因子Ｔａｓ等调节蛋白．本研究利用我们实验室分离鉴定的ＢＦＶ３０２６中国毒株［１２］为材料，克隆Ｏｒｆ－１基因，构建ｐＢＦＶＯＲＦ－１表达质粒，通过带有ｌｕｃ基因的ＬＴＲ系列缺失质粒与ｐＢＦＶＯＲＦ－１共转染，瞬时表达分析结果将ＢＦＶＬＴＲ上Ｔａｓ应答元件（ＴＲＥ）定位于－９８３／－６６８（ＴＲＥＩ），－４７０／－１４０（ＴＲＥＩ）和ＲＵ５区．其中ＴＲＥＩ、ＴＲＥＩＩ为正调控区域，ＲＵ５为负调控区域，并进一步证明ＲＵ５在异源启动子（ＢＩＶＬＴＲ）上具有抑制其下游基因表达的功能．这些结果表明ＢＦＶＴａｓ作用机理与慢病毒（Ｔａｔ）。

用RACE技术快速扩增五指山猪来源的猪内源性反转录病毒3'LTR

测定我国小型猪来源的猪内源性反转录病毒(PERV)3'LTR,以便于PERV全基因的克隆和分析。用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从五指山猪外周血淋巴细胞mRNA中扩增到PERV-3'LTR,并克隆入pGEM-Teasy载体,将阳性克隆进行序列测定和同源性分析。测序结果显示该克隆3'端的尾部有一个由12个A组成的poly(A)信号;其R区与PERV-MSL的R区(约64bp)基本一致,同源性分析表明其与PERV-MSL的3'LTR具有81%的序列同源性。说明成功扩增了我国五指山猪来源的PERV-3'LTR,将有利于PERV全基因的克隆。

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株及其亲本驴强毒株长末端重复序列(LTR)的启动子活性比较

将马传染性贫血病毒驴强毒(donkey adaptedequineinfectiousanemiavirus,D AEIAV)、马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒(donkeyleukocyteattenuatedEIAV,DLAEIAV)及EIAVWyoming株的全长长末端重复序列(LTR)分别克隆到报告基因载体pCAT Basicvector中,获得重组质粒p D A LTR CAT、p DLA LTR CAT及p Wyo LTR CAT。将这3个重组质粒分别体外转染EIAV阴性健康驴的白细胞,比较这三者LTR启动报告基因CAT表达的基础活性和在tat pcDNA3共转染条件下激活活性的差异。结果表明:在驴白细胞中,DLAEIAVLTR启动CAT表达的活性略高于D AEIAVLTR;而与EIAVWyoming株LTR比较,DLAEIAV与D AEIAV二者LTR启动CAT表达的活性都较低。在有共转染重组表达质粒tat pcDNA3条件下,D AEIAV、DLAEIAV及EIAVWyoming株LTR起始CAT表达的活性都得到提高,分别提高了4 8倍、6 0倍和3 2倍。上述结果提示,LTR可能是体现DLAEIAV驴白细胞适应性的因素,不一定是影响其毒力减弱的根本原因。

BB染色体组野生种花生LTR反转录转座子RT基因的多样性分析

利用简并PCR技术从野生花生种(Arachis ipaensis Krapov.et W.C.Greg.)的基因组中扩增分离Ty1-copia类(1类)和Ty3-gypsy类(2类)反转录转座子RT基因,并对其序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性进行分析。结果显示:对于1和2类RT基因,目的条带分别约为260和430 bp;分离获得了23和32条序列,长度范围分别为262~266、395~435 bp;AT所占比例分别为61.60%~69.17%和55.79%~61.34%;核苷酸序列间相似性分别为52.5%~98.9%和45.0%~98.8%,氨基酸序列间相似性分别为39.8%~100%和9.0%~97.2%。其中2类基因的异质性高于1类;1类和2类基因分别有3条和15条发生了无义突变,2类的无义突变发生率远高于1类。1类基因的保守基序保守性较高,2类的保守基序呈一定程度的变异。代表序列的蛋白质三级结构基本类似。聚类分析结果显示,1类和2类基因可被分为5个和6个家族。1类和2类基因都有部分序列与其他物种的RT基因序列亲缘关系较近,表明它们之间可能存在两类反转录转座子的横向传递。通过比对花生EST数据库,本研究发现1类有1条以及2类有7条序列为具有转录活性的反转录转座子,且2类基因比1类更具有转录活性。

马传染性贫血病毒非编码区LTR嵌合克隆的生物学特性

将已构建的马传染性贫血病毒LTR强弱毒嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12体内接种健康试验马,在150d观察期内,各组试验动物体症均未见异常。血液学分析发现,vLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与亲本弱毒疫苗株的白细胞与血红蛋白含量总体上没有明显的规律性的变化。在动物外周血中均检测到一定的病毒RNA拷贝数,但拷贝数较低。二者在诱导EIAV特异性淋巴细胞增殖功能和特异性细胞毒性杀伤反应中,亦具有相似的变化趋势和效应。本项研究为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础。

白细胞介素32通过5'-LTR抑制HIV复制

目的:探讨白细胞介素32(IL-32)抑制HIV病毒复制的机制.方法:利用荧光色素酶活性测定筛选抑制HIV复制最显著的IL-32亚型,通过构建HIV的LTR系列截断质粒和TAR茎环结构的系列点突变质粒,确定IL-32抑制HIV复制作用的位点.结果:在Hela、Jurkat、293T三个细胞系中,IL-32γ和IL-32ε两种亚型对HIV的抑制作用最显著.在Hela细胞系中证实IL-32可通过抑制HIV 5'-LTR的活性抑制HIV复制,确定TAR形成的茎环结构在此过程中起重要作用.IL-32与TAR结构相互作用的位点定位在TAR的环状和半环状处.结论:IL-32能抑制HIV复制,可作为HIV治疗的潜在手段.

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）的长末端重复序列（ＬＴＲ）含有病毒的启动子，调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ一Ｌｕｃ，该质粒能在Ｅｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性，从而证明ＢＩＶＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。Ｍｕｎｇｂｅａｎ核酸酶作图分析发现，ＢＩＶＬＴＲ在Ｅｃｏｌｉ中的转录起始位点位于Ｕ_３区，而不是在真核细胞中的Ｕ＿３一Ｒ交界处。同时我们也证实了ＢＩＶＬＴＲ在Ｅ，ｃｏｌｉ中仍可被ＢＩＶｔａｔ蛋白特异性地反式激活，为研究ｔａｔ蛋白的作用机制提供了一条新的途径。

BIV－LTR中存在负调控区

为研究ＢＩＶ－ＬＴＲ调控序列的功能，将ＬＴＲ部分ＤＮＡ序列缺失，与荧光素酶基因相连构建质粒ｐＤ－３１９－Ｌｕｃ，ｐＤ－２６１－Ｌｕｃ，ｐＤ－１８１－Ｌｕｃ，ｐＤ－２－Ｌｕｃ，ｐＤ＋３２－Ｌｕｃ，ｐＤ－３１９－２６１－Ｌｕｃ，ｐＤ－１８１＋３２－Ｌｕｃ．通过磷酸钙共沉淀法将上述质粒及ｐＢＬＴＲ－Ｌｕｃ分别转染小牛肺细胞（ＦＢＬ），检测转染细胞裂解物荧光素酶活性，比较各质粒所克隆的ＢＩＶ－ＬＴＲ表达水平，发现－２６１位上游区存在负调控区，Ｒ区存在抑制ＬＴＲ表达的序列．

人类逆转录病毒的长末段重复序列(HRTVLTR)的表达与肺癌转移的关系

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一 .肺腺癌很容易发生转移 .实验以 17例肺癌 (5例肺腺癌、1例腺鳞癌、7例肺鳞癌及 4例小细胞末分化癌 )的原发灶、癌旁正常组织及转移淋巴结为材料 ,采用PCR及非放射性标记的 RNA斑点杂交分析 L TR在基因组的存在及其表达情况 .研究结果发现 :LTR序列在 17例肺癌病人的正常组织及肿瘤组织的基因组中普遍存在 ,L TR致肺癌转移与其插入基因组中无关 ;L TR致肺癌转移与其表达增高有关 ,而且其高表达与小细胞肺癌的转移无关 ,而与非小细胞肺癌的转移密切相关 .提示 L TR参与了非小细胞肺癌的转移过程 .