基于多重长PCR靶向捕获测序技术的高同源SNP鉴定

为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。

应用长PCR扩增蝗虫线粒体全基因组

介绍了用两对长PCR引物扩增蝗虫(Acridoidea)线粒体全基因组的方法。从NCBI的核酸数据库下载得到36种已测昆虫线粒体全基因组,选取cytochromeb(Cytb)c、ytochrome oxidase subunitⅡ(COⅡ)、cytochrome oxidase subunitⅠ(COⅠ)基因的保守区域设计两对引物。其中引物LP03和LP04从COⅠ向Cytb扩增;引物LPCytb和LPCOⅡ从Cytb向COⅡ扩增,两对引物扩增的片段之间有大约1 kb的重叠。应用这两对引物成功扩增出10种蝗虫的线粒体基因组。考虑到在设计引物过程中所选序列在其他昆虫中的保守性,它们应能在大部分昆虫线粒体基因组扩增中发挥作用。

LA-PCR快速克隆传染性法氏囊病病毒基因组A节段全长cDNA方法的建立

从浙江省某鸡场暴发疑似传染性法氏囊病 (IBD)的法氏囊病料中分离到 1株致死率高达 70 %的强毒株 (IBDV-ZJ2 0 0 0 )。通过筛选 ,采用效果最理想的蛋白酶 K法从法氏囊中提取病毒基因组 RNA,经 L i Cl纯化后 ,优化各种反应参数和条件 ,建立了 L ong- accurate PCR(L A- PCR)一步直接扩增 IBDV A节段全长 c DNA的方法 ,得到一约 3.2 6 kb的片段。L A- PCR法能快速从病鸡法氏囊和细胞适应毒中扩增 A节段全长 c DNA,为研究各 IBDV毒株 A节段的结构和功能打下了基础。

用长距PCR法构建恶性疟原虫cDNA表达文库

目的 构建恶性疟原虫cDNA表达文库。方法 用Trizol试剂盒提取总RNA ,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物 CDSⅢ引物直接用总RNA选择性地反转录成单链cDNA ,再用长距PCR(LD)方法选择性地扩增出双链cDNA ,经蛋白酶K消化和酶切后 ,用玻璃奶试剂盒回收 2 0 0bp以上DNA片断 ,经与载体λTriplEX2连接和蛋白抽提物体外包装后 ,构建成cDNA文库并对文库进行了初步的鉴定。结果 构建了高滴度 ,高重组率的恶性疟原虫cDNA表达文库。结论 所构建的疟原虫cDNA文库适合进一步筛选抗疟原虫药物结合蛋白基因。

长链PCR技术评价^(60)Co-γ射线灭活病毒的研究

目的探讨用长链PCR技术评价60Co-γ射线辐照灭活伪狂犬病毒(pseudorabies virusPRV),后残余病毒感染性的可行性。方法针对PRV糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用PCR扩增经不同剂量60Co-γ射线照射后的PRV核酸,并同时以细胞感染法做平行对照。结果60Co-γ射线辐射对PRV核酸的破坏有剂量依赖性,随着60Co-γ射线剂量的增加,PRV核酸被破坏程度增加,剂量≥20kGy时完全被灭活。5条不同长度PCR扩增产物中,只有长片段3.9kb的检出与细胞培养结果一致。结论γ射线对PRV核酸的损伤程度随γ射线剂量增加而增大;用长链PCR(3.9kb)来评价经60Co-γ射线辐照灭活病毒后残余病毒的感染性是可行的。

长PCR技术及其在动物学研究中的应用

长PCR(longPCR)技术自 1 994年发明以来 ,在生命科学发展中发挥了巨大的作用。长PCR技术与常规PCR有较大的区别。本文从长PCR技术的由来、长PCR技术对模板、引物和聚合酶的特殊要求及长PCR技术反应条件等方面进行了较全面的介绍。最后介绍了近期发展的LR IPCR(longrange inversePCR ,长反向PCR)、内切酶介导性长PCR (endonuclease mediatedlongPCR)、longRT PCR以及LDD PCR。目前此技术在动物学研究中的应用主要在基因组测序和线粒体基因组研究、病理诊断、基因差异表达、病原微生物的研究、遗传多态性分析等领域。

以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA

目的以长链PCR(Long-PCR)技术为基础,应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒(JEV)全长基因组。方法根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物,分别扩增JEVSA14-14-2株的5′和3′半长分子,在5′端上游引物中引入T7启动子核心序列。利用细胞培养增殖病毒,提取病毒RNA,逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5′和3′两个半长分子,在此基础上进行融合PCR,得到JEV全长cDNA分子,克隆入pGEMT-easy载体,酶切鉴定并测序。结果扩增出均6000bp的JEV的5′和3′两个半长分子及约11000bp的全长cDNA片段,其二级结构丰富的非编码区未发生缺失。JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性最高达99%,其氨基酸序列同源性最高达96.3%。其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较,核苷酸序列同源性高达98%～99%,氨基酸序列也未出现较大差异。结论已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组,为进一步构建感染性克隆奠定了基础。

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT-PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株(NGC)全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物,在上游引物中加入Sp6 RNA聚合酶启动子核心序列,下游引物中加入ClaⅠ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT-PCR法扩增出约11 kb基因片段,经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT-PCR技术,获得了登革2型病毒NGC株全长基因组,为进一步构建感染性克隆打下基础。

单环刺螠线粒体基因组全序列的获得——长PCR结合鸟枪法测序

由于具有单基因所不可比拟的优势,线粒体基因组现已成为后生动物种群遗传和分子系统发育研究中一个重要的信息来源。本研究选取螠虫动物的代表物种——单环刺螠(Urechis unicinctus),详细阐述了利用长PCR方法扩增其线粒体DNA,获得约15 kb的扩增产物,进而构建shotgun文库,最终成功获得单环刺螠线粒体基因组全序列的流程。本实验流程样品需求量少、设备要求低、简便快捷。

倒位PCR法检测血友病A FⅧ基因内含子22/1倒位

目的建立血友病A(hemophilia A,HA)FⅧ基因第22内含子倒位PCR检测法,并初步应用于HA直接基因诊断。方法应用倒位PCR(inversion-PCR,I-PCR)方法对24个HA家系中所有先证者的FⅧ基因22内含子倒位进行检测,对检测阳性者的母亲进一步用上述方法行携带者诊断,并对其中1例进行羊水产前基因诊断。检测阴性者再行内含子1倒位筛查。结果 24个HA家系中,7例先证者的F基因内含子22倒位检测为阳性,阳性检出率、可诊断率分别为29.17%、100%,未发现内含子1倒位;7例内含子22倒位突变阳性患者的母亲有6例为倒位携带者,羊水诊断未发现内含子22/1倒位。结论 I-PCR法能准确地检测F基因22内含子倒位突变,可应用于HA患者及携带者FⅧ基因22内含子倒位基因诊断及产前诊断。

长距离PCR检测重型血友病A病人凝血因子Ⅷ基因倒位

为了筛查山东省重型血友病A(hemophiliaA ,HA)凝血因子Ⅷ基因倒位的患者并检出携带者 ,采用长距离DNA扩增 (LD PCR)方法 ,以 0 .6 %琼脂糖凝胶电泳技术 ,检测临床上确诊的 5 5例重型HA患者及其家系成员中是否存在凝血因子Ⅷ (FⅧ )基因倒位。电泳出现 11kb带 ,示凝血因子Ⅷ基因倒位 ;12kb带 ,示非倒位 ;这两条带同时出现者为凝血因子Ⅷ基因倒位携带者。结果表明 :5 5例无亲缘关系的重型HA患者中 ,发现 2 2例患者 (或家系成员 )有凝血因子Ⅷ基因倒位 ,占重型HA患者的 4 0 % ;15个家系中查出基因倒位携带者 5名。结论 :运用LD PCR技术可以准确、简便、快速地检测重型血友病A患者是否存在凝血因子Ⅷ基因倒位。

长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列

为解决传统反向PCR技术扩增片段短、假阳性多的不足,建立了长距离反向PCR(LD I-PCR)扩增技术:0.5μg DNA/mL的反应体系使DNA酶解片段充分自身环化连接,其产物用25 nt^30 nt的序列特异引物进行长距离PCR。结果表明该方法能特异地扩增出长达16 kb的序列,在已知DNA片段的侧翼序列克隆方面具有高效、简便、特异的优点。

日本脑炎病毒WHe株全长cDNA的长链RT-PCR法的扩增

为深入探索日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)WHe株的致病机理,并为新型疫苗研发提供技术支持,采用长链RT-PCR技术对其基因组全长cDNA进行了扩增鉴定,并对含复杂二级结构的3′末端和5′末端非编码区扩增片段进行了测序分析。扩增结果表明,扩增出的JEV WHe株基因组全长cDNA分子近11 kb大小;非编码区测序分析表明,扩增产物为WHe株所特有。提示长链RT-PCR法可用于JEV WHe株基因组全长cD-NA的扩增。

长引物快速PCR结合核酸试纸条法可视化检测四种病原体

目的建立一种基于病原体核酸分子的血液安全性检定方法,可视化区分血液中乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)和梅毒螺旋体(TP)。方法利用长引物PCR扩增四种病原体核酸,循环步骤由传统的三步简化为两步。将修饰有小分子抗原的扩增产物点样于固定有相应抗体的纳米颗粒试纸条上,肉眼判读显色结果。优化了长引物PCR对于四种病原体扩增的退火和变性温度,并评价了该方法用于病原体阳参及血清样本的检测准确性。结果四种病原体核酸扩增的退火温度分别为76℃、78℃、76℃和78℃;变性温度为84℃、90℃、84℃和88℃;本方法能成功区分四种病原体的阴阳性样本,准确性高;扩增时间仅为40 min/40个循环,检测为10 min。结论该方法能够用于四种病原体核酸的可视化检测,与传统的检测方法相比,检测速度快,成本低,无需昂贵的仪器,易于广大基层医院普及。

用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因

目的与方法 :使用连续长片段 RT- PCR,扩增 HCV的结构基因。 结果 :利用连续长片段 RT- PCR技术 ,结合热启动和两段 PCR一次扩增出长 2 .3kb的 HCV结构基因和部分调控序列 ,并用测量分子质量和限制性酶切的方法进行了鉴定。 结论 :利用长片段 RT- PCR可一次扩增出 C、E1、E2基因和部分 5 - N TR。

螺旋通道微流控PCR芯片连续自动扩增DNA片段的研究

研制了由内向外流动的螺旋通道微流控 PCR玻璃芯片 ,减少了 PCR反应液在微通道中流动时的分散和阻力 ;讨论了扩增循环数和进样速度对长片段基因扩增的影响 ,在 2 6min内成功扩增了质量浓度仅为1 0 ng/m L的 60 1 2 bpλ-DNA;通过将小孔径石英毛细管作为顺序注射 (SI)系统的连接管路 ,使其死体积降到 0 .3 0 μL.实现了微升级样品的自动换样、连续 PCR扩增和微通道洗涤等功能 .样品间无交叉污染 .每小时可扩增 5 0 0 bpλ-DNA试样 7个 .扩增产物片段大小和荧光强度的相对标准偏差分别为 0 .4%和 6.7% .

长片段基因FMNL2 PCR实验的体会

目的尝试扩增长片段FMNL2基因。方法采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT的扩增。结果高效、特异地扩增出FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT片段。结论巢式PCR或和降落PCR相结合,提高了目的基因的扩增效率和扩增产物的特异性。

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因。方法采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶酶切分析。结果设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物；经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段；经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论以本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。

利用PCR-SSCP对人MINK基因的研究

人类MINK基因的两种突变导致长QT综合征（LQTS）。我们设计了两对引物利用PCR－SSCP结合直接测序法在病人及健康者中对MINK基因进行分析，结果发现第149位密码子产生A→G转换。在所研究的对象中，此变化在病人及正常对照者中均有存在。提示MINK基因的此突变性质为非病理性的多态突变。