染色体短期培养法的改良及在白血病患者染色体核型分析中的应用

目的改良骨髓染色体短期培养法并对130例白血病患者进行染色体核型分析。方法通过单因子梯度实验,对影响骨髓染色体短期培养法的秋水仙素浓度、作用时间、低渗时间等主要因素进行优化,并在改良基础上,进行了3因素3水平正交实验优化骨髓染色体制备体系,进一步对我院130例白血病患者进行了染色体核型分析。结果秋水仙素浓度、秋水仙素作用时间、低渗时间等因素都有适宜的范围,过高或过低都会影响染色体制备成功率,正交实验结果表明骨髓染色体制备的最适体系为秋水仙素质量浓度0.07μg/mL,作用时间80min,低渗时间35min。通过改良的染色体短期培养法对130例白血病患者进行了染色体核型分析,染色体制备成功率达到了97.69%,异常核型检出率为82.3%。结论 0.07μg/mL秋水仙素作用80min,低渗时间35min的改良骨髓染色体制备体系值得临床推广。

骨髓基质细胞的造血支持作用等生物学特性的研究

目的研究人骨髓基质细胞体外长期培养的生物学特性和造血支持功能。方法①采用静置贴壁细胞培养法，体外长期培养胎儿、儿童和成人的骨髓基质细胞。②采用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪检测法，分析细胞的表型。③将不同发育阶段的骨髓基质细胞体外培养，并扩增脐血造血干细胞。结果①建立了成纤维肌样细胞系，可传至１０代，维持６个月，同时还培养出内皮细胞和巨噬细胞。②儿童骨髓基质肌样细胞的染色特征为：波形纤维蛋白（ｖｉｅｍｅｎｔｉｎ）呈阳性，第Ⅷ因子呈阴性；儿童骨髓基质细胞的表型为：ＣＤ３３－、ＣＤ３４－、ＣＤ３８－和ＣＤＷ９０＋；成人为：ＣＤ３３－、ＣＤ３４－、ＣＤ３８＋和ＣＤＷ９０＋。③基质细胞能长期维持脐血中ＬＴＣ－ＩＣ的生存。若加入ＩＬ－６、ＩＬ－３和ＳＣＦ扩增体系，基质细胞对长期维持和扩增ＬＴＣ－ＩＣ的效果更为明显（Ｐ〈０．０１），较无基质细胞的对照组所形成的ＬＴＣ－ＩＣ产率高２－４倍。结论人骨髓基质细胞体外可长期培养，对脐血干细胞具有造血支持功能。

急性白血病骨髓基质细胞生物学特点的观察

目的探讨白血病骨髓基质对白血病形成的作用机制。方法白血病患者和正常人的骨髓单个核细胞行基质细胞培养,动态观察贴壁时间、小丛形成时间、集落形成时间、融合形成时间等生长特性,计数CFU-F集落,检测基质细胞VCAM-1、Fn及培养上清液中的IL-6、TNF-α含量。结果急性白血病骨髓基质细胞生长延迟,贴壁形成时间、小丛形成时间、集落形成时间和融合形成时间均明显晚于正常骨髓基质组(P<0.05);CFU-F计数和VCAM-1表达水平均明显低于正常对照组(P<0.05),Fn与正常对照组无显著性差异(P>0.05);骨髓基质细胞培养上清液中IL-6、TNF-α含量明显高于正常对照组(P<0.05)。结论急性白血病存在造血微环境异常。

长期骨髓培养、白细胞介素2、干扰素α_(2a)体外净化慢性粒细胞白血病骨髓的研究

用长期骨髓培养（ＬＴＢＭＣ）和白细胞介素２（ＩＬ－２，１０００Ｕ／ｍｌ），干扰素α２ａ（ＩＦＮ－α２ａ，１０００Ｕ／ｍｌ）不同的组合方案，对１０例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）骨髓进行体外净化培养２周。结果发现：①单用ＬＴＢＭＣ体系其净化效果差；②加入ＩＬ－２后，对ＣＭＬ的ＣＦＵ－ＧＭ以及ｐｈ＇（＋）细胞有明显的杀伤作用（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）对正常的ＣＦＵ－ＧＭ则无影响；③ＩＦＮ－α２ａ在ＬＴＢＭＣ体系中抑制ｐｈ＇（＋）细胞生长而不影响ＣＭＬ和正常的ＣＦＵ－ＧＭ；④ＬＴＢＭＣ、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α２ａ三者净化ＣＭＬ骨髓具有协同作用。结果提示：ＬＴＢＭＣ、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α２ａ联合净化效果好。

细胞因子诱导的杀伤细胞对慢性髓性白血病细胞的体外净化作用

在长期骨髓培养(LTBMC)7—9天的基础上,配对比较观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)+白细胞介素2(IL-2)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)+IL-2或IL-2活化的骨髓细胞或单纯LTBMC对慢性髓性白血病(CML)患者骨髓Ph^+细胞的净化作用。结果为LTBMC+CIK+IL-2组(n=8)细胞的Ph^+百分率明显低于单纯LTBMC组(n=8,P<0.001),也低于LTBMC+LAN+IL-2组(n=3)或单纯IL-2(n=3)。结论:CIK+IL-2与LTBMC对CML患者骨髓Ph^+细胞的净化有明显的协同作用。

干扰素α联合体外长期液体培养净化慢性髓细胞白血病骨髓的实验研究

用干扰素α(IFN-α)联合体外长期骨髓液体培养(LTBMC)净化16例慢性期Ph^+慢性髓细胞白血病(CML)的骨髓,研究结果为:IFN-α1000IU/ml和2×10~6MNC/ml对LTBMC中CML和正常骨髓的非贴壁层细胞数无明显影响,对CML培养3周后和正常骨髓培养第2—3周的非贴壁层CFU-GM有抑制作用,对CML和正常骨髓在LTBMC中的基质细胞层形成均有一定影响。在有完整染色体资料的13例患者中,加IFN-α组培养4周后有8例Ph^+染色体完全消失,2例Ph^+<50％,1例Ph^60％,2例无变化,而对照组中只有5例完全消失,3例Ph^+<50％,1例Ph^+65％,4例无变化,而且加IFN-α组Ph染色体的消失或减少时间较对照组提前1周。结论:IFN-α1000U/ml与LTBMC联合对CML骨髓的净化有协同效应,两者联合可用于临床净化慢性期CML骨髓。

长期培养的急性粒细胞白血病患者骨髓贴壁细胞中src原癌基因的高水平表达

在人骨髓细胞长期培养中,观察造血细胞与基质细胞的关系,检测不同类型的白血病患者及其他非血液病患者骨髓贴壁细胞中src原癌基因的mRNA表达水平。基质细胞培养采用人骨髓细胞长期培养的方法,mRNA表达的检测采用地高辛标记cDNA探针和细胞原位斑点杂交法。培养4-6周时,部分急性粒细胞白血病(AML),慢性粒细胞白血病(CML)及骨髓增生异常综合征(MDS)患者的造血细胞获得独立生长的能力。与对照组相比,AML患者骨髓贴壁细胞中src原癌基因表达明显增高(P<0.05)。src原癌基因的高表达,提示在白血病发病中有造血微环境异常。

在骨髓长期培养中基质细胞间的相互关系

本实验观察,在骨髓长期培养中各种基质细胞间的相互关系和特殊的连接结构。免疫电镜观察表明,上皮样基质细胞具有分泌纤维结合蛋白(Fn)的功能,后者在细胞与基质及细胞间的连接中起介导作用。

MIP-1β对长期培养体系中造血祖细胞增殖的影响

目的 :探讨MIP - 1β对长期培养体系中造血祖细胞增殖的影响。方法 :在骨髓长期培养的第 3、4、5周 ,分别加入MIP - 1β ,每周半换液时换出上清进行细胞计数 ,做CFU -GM培养。第 6周做3HTdR自杀实验 ,检测CFU -HPP。结果 :加MIP - 1β组上清中有核细胞数 ,CFU -GM数较对照组略有增加 ,但无显著差异(P >0 .0 5 ) ;第 6周MIP - 1β组造血祖细胞3HTdR自杀率较对照组明显增高。 (P <0 .0 5 )。CFU -HPP与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :MIP - 1β可解除骨髓基质层的内源性抑制活性 。

阿糖胞苷对人骨髓细胞长期培养的影响

人骨髓细胞长期培养（ＬＴＨＭＣ）加入３５μｇ／ｍｌ阿糖胞苷并孵育１小时后中止，然后继续培养。４周龄ＬＴＨＭＣ的造血被抑制；但１８周龄ＬＴＨＭＣ则表现为培养上清液中非粘附细胞数上升，１４天达高峰；基质层出现造血区，原已退缩的基质层有新的基质细胞生长。提示１８周龄ＬＴＨＭＣ仍有造血潜力。

骨髓基质细胞的造血支持作用等生物学特性的研究

采用静置贴壁细胞培养法，体外长期培养了胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞，时间为６个月，可传至１０代，并观察了成纤维肌样细胞、内皮细胞和巨噬细胞；通过免疫细胞化学染色法，证明了１～３代的骨髓基质肌样细胞Ｖｉｅｍｅｎｔｉｎ为阳性，第Ⅷ因子阴性；采用流式细胞仪检测法，证明了儿童骨髓基质细胞的细胞表型为ＣＤ３３－和ＣＤ３４－、ＣＤ３８－、ＣＤ＋Ｗ９０，成人骨髓基质细胞为ＣＤ－３３、ＣＤ－３４、ＣＤ＋３８、ＣＤ＋Ｗ９０。 采用体外培养和扩增的脐血造血干细胞的半固体集落形成法，证明了基质细胞能长期维持脐血中的ＬＴＣ－ＩＣ的生存，若加入ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＳＣＦ细胞因子的扩增体系，基质细胞对长期维持和扩增ＬＴＣ－ＩＣ的效果更为明显（Ｐ＜０．０１），比无基质细胞的对照组所形成的ＬＴＣ－ＩＣ产率高于２～４倍。表明骨髓基质细胞具有支持造血功能。

急性非淋巴细胞性白血病体外长期培养的生长类型与临床关系

作者应用Ｄｅｘｔｅｒ长期培养体系进行了１７例急性非淋巴细胞性白血病（ＡＮＬＬ）骨髓的长期培养，按照培养４周后基质细胞、ＣＦＵ－ＡＮＬＬ和ＣＦＵ－ＧＭ的生长情况，将其生长状态分为三型．Ⅰ型（１１／１７例）为培养净化有效型；Ⅱ型（３／１７例）为部分净化有效或需经４周以上培养观察其净化效果型；Ⅲ型（３／１７）其基质细胞缺陷，体外培养各种细胞均同步死亡．Ⅰ型患者化疗后有效率（８１．８％）比Ⅱ型（６６．７％）和Ⅲ型（３３．３％）显著地高（Ｐ＜０．０５）．该结果提示临床应用Ｄｅｘｔｅｒ体系净化白血病细胞进行自体骨髓移植时，应按其体外生长类型选择患者，此类型分类与临床状态无关，其净化作用与临床化疗之间无选择性交叉抗肿瘤作用．

人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性

为了长期培养人骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性 ,我们采用静置贴壁培养法 ,体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞 ,并将传至 5代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变 (CPE)法 ,开展了对 5种病毒的敏感性试验。结果表明 ,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒 ,脊髓灰质炎病毒、I型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感 ,能产生明显的CPE ,其效价 (TCID50 )可达10 - 3～ 10 - 4,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对病毒敏感性至少比儿童高 2倍 ,比成人高 4倍 ,即胎儿>儿童 >成人 ,但对B3型柯萨奇病毒均不敏感。我们的研究结果不仅可为人骨髓基质细胞体外长期培养提供了确实可行的简便方法 ,而且为该细胞对病毒的敏感性提供了实验依据 ,并为该细胞的利用开辟了新的应用前景。

人骨髓细胞体外长期培养基质层细胞的分类及其变化

人骨髓细胞体外长期培养基质层细胞按其核浆、形态特征分为四类：ＡＣ１最大，有数个明显核仁，胞浆呈薄纱状；ＡＣ２与巨噬细胞类似，核小深染，胞内有吞噬物；ＡＣ３最显著的特征是胞浆内广泛分布的脂质空泡；ＡＣ４最小，核大深染，胞浆少。从培养第４周至第８周，ＡＣ１及ＡＣ２分别从２１．７５％、３１．２５％上升至４０．５％、５５％；ＡＣ３及ＡＣ４分别从３１％、１５．５％降至１．５％、３％。碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶（ＡＰＡＡＰ）法检测细胞表面抗原，可见ＡＣ１纤维联结蛋白阳性，ＡＣ２的ＣＤ６８强阳性，ＡＣ３的纤维联结蛋白弱阳性，ＡＣ４的上两种单抗及因子ＶＩＩＩ相关活性抗原均标记阴性。本实验结果可作为一个参考值，衡量在各种实验条件下基质层细胞组成的变化。

多发性骨髓瘤的骨髓细胞长期培养的研究

多发性骨髓瘤的骨髓细胞置于Dexter长期培养体系中,浆细胞可以长期生长。非贴壁层细胞形成CFU-GM的能力达6周以上,但随着培养时间的延长,CFU-GM的形成活性明显下降。浆细胞产生兔疫球蛋白单克隆特异性在Dexter长期培养体系中仍维持不变,但Ki-67阳性的浆细胞随着培养时间的延长而减少,以上结果说明浆细胞虽然可以在Dexter培养体系中生长并保持单克隆特异性,但此种培养体系不是浆细胞最佳的生长条件。本研究还表明Dexter长期培养不宜作为骨髓净化的手段用于多发性骨髓瘤的自体骨髓移植。

B_3HM细胞内活性物质对小鼠造血的作用

目的 观察B3HM细胞条件培养液 (B3HM CM )和细胞匀浆组分对小鼠造血细胞的作用。寻找其中可能存在的诱导造血细胞发生恶性转化的活性物质。方法 将B3HM CM加到小鼠骨髓长期培养体系中 ,定期计数细胞生长情况 ;用B3HM CM或经差速离心法分离的B3HM细胞匀浆组分注射经照射处理的小鼠 ,观察小鼠存活情况和造血细胞的变化。结果 B3HM CM在骨髓培养体系中促巨核细胞增殖 ,在小鼠体内促造血细胞增多。B3HM细胞匀浆第 3组分可诱发小鼠白血病。

IL-3体外造血支持效应的初步研究

目的 :探讨IL 3体外促进脐血造血细胞增殖分化的效应。方法 :连续 2次Ficoll Hypaque分离 ,初步纯化脐血造血细胞 ,将其单个核细胞接种于经γ射线预处理的成人骨髓基质细胞层上 ,加入适量IL 3,并设不加IL 3的对照组 ,持续培养 6w ,定期检测非粘附细胞和集落形成细胞 (CFC)。结果 :IL 3组 3～ 6w非粘附细胞数和CFC产率显著高于对照组 ,分别为对照组的 2 .7～4.5倍和 1.6～ 2 .3倍。结论 :IL

IDA对白血病骨髓基质培养体系中HL-60细胞杀伤效应的观察

目的 :研究细胞毒药物对体外残留白血病模型中HL 6 0细胞的杀伤效应。方法 :采用Dexter型骨髓培养体系形成白血病骨髓基质细胞贴壁层 ,接种HL 6 0细胞共培养 ,用去甲氧基柔红霉素 (IDA)处理后 ,动态观察HL 6 0细胞的活性变化。结果 :随着IDA剂量的增加及培养时间的延长 ,HL 6 0细胞活力逐渐减弱 ,去甲氧基柔红霉素 (IDA)与骨髓基质细胞层或单纯的培养基体外孵育对HL 6 0细胞杀伤能力减弱。结论 :急性白血病骨髓基质有助于HL 6 0细胞逃避化疗药物杀伤 ,对残留白血病的形成具有重要作用。

骨髓细胞体外长期培养前后特性比较及其临床意义

目的通过体外骨髓细胞的培养，观察其细胞特征，为临床治疗疾病提供新的帮助。方法对10例急性白血病患者和5例正常人进行体外长期骨髓细胞培养：结果获得了3株与基质细胞共生的有长期生存力的造血细胞，其形态原始，这些细胞均有造血干细胞标记，其细胞化学、细胞表面免疫标记及超微结构与培养前细胞相比均发生了很大的变化，其中1例急性白血病原有核型异常者经培养后只出现正常核型。这些细胞在体外可以增殖，培养3个月足够达到骨髓移植所需细胞数。结论初步分析这些细胞为正常造血细胞，可用于目前所进行的造血干细胞移植，为今后造血干细胞移植开创一个新的方法。

急性白血病患者骨髓基质造血微环境的某些异常<英文>

为了探索人白血病骨髓造血微环境的异常所在,本实验采用胶体金标记及银增染的免疫电镜方法,检测了急性白血病患者及正常人骨髓长期培养的基质细胞某些生长因子、粘附分子及细胞外基质的表达情况。结果表明,急性白血病患者长期培养的基质细胞表达的GM-CSF(粒-巨噬系集落刺激因子)较对照组高,淋巴细胞归巢相关粘附分子(HCAM),血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)较对照组低,纤连蛋白(Fn)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)与对照组无差别。结论提示急性白血病患者骨髓长期培养的基质细胞某些生长因子和粘附分子表达异常。