香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其应用

用纯化的香蕉束顶病毒(BBTV)抗原免疫BALB/C小鼠。取脾脏细胞与骨髓瘤NS-1细胞融合。经HAT培养液选择性培养,间接ELISA方法筛选阳性孔。阳性杂交瘤用有限稀释法克隆,间接ELISA法复筛,最后获得201E_3、302C_4两株稳定分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其免疫球蛋白亚类为IgM。纯化后的腹水抗体,用间接ELISA和斑点法(DIA)检测了采自云南河口、个旧和澳大利亚的BBTV病样样品,表现出特异性反应。最高效价达1:64000,培养上清液效价为1:16。经3个月连续培养,仍能稳定分泌抗BBTV McAb.结果表明,已建立了稳定分泌抗香蕉束顶病毒特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。制备的McAb能应用于香蕉束顶病的诊断和病毒的研究。

香蕉束顶病毒株系生物学特性的研究

在广东香蕉束顶病株症状基本相同的情况下 ,在 8个产区分别随机采集 11～ 15个标样共 111个分离物 ,接种在香蕉苗上 ,其后又从 8个产区的分离物中各选取 1个代表分离物用于进行各项研究。寄主范围试验结果 ,这 8个代表分离物可分为能侵染粉蕉的 NSP株系 (以广州天河分离物为代表的 7个分离物 )和不能侵染粉蕉的 NS株系 (高州代表分离物 )。用 Eco RI对 8个毒源地的 111个分离物 DNA组分 1进行酶切分析 ,结果表明 :所有高州分离物共 15个和信宜分离物 14个中的 9个都可以被酶切 ,应属 NS株系 ;而其余 6个毒源地的所有分离物及信宜分离物中的另外 5个都不能被酶切 ,应属 NSP株系。在病害潜育期方面 ,2个株系在大蕉上的差异达到显著水平 ;在香蕉 4个品种上 ,2株系也存在较明显的差异 ,但其中有些差异未达到显著水平。在病毒增殖、运转速度及病毒达到高浓度所需的时间上 ,2个株系也存在显著的差异。

香蕉束顶病毒的纯化及理化特性

从具有典型香蕉束顶病(BBTD)症状的香蕉病组织中提纯了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)。电镜下可观察到直径为18nm的球形病毒颗粒。最高紫外吸收在255nm,最低紫外吸收在240nm,A_(260)/A_(280)为1.30。用标准BBTV抗体通过ECL-Western转印法测定其外壳蛋白分子量为21kDa。其核酸经DNaseI、RNaseA和Mung Bean Nuclease分析,表明是约1kb的ssDNA。结果与国外文献报道一致。

利用超低温保存方法脱除香蕉束顶病毒的研究

香蕉束顶病毒(BBTV)是香蕉生产中的严重病害之一,主要通过感病材料和香蕉交脉蚜等昆虫进行传播,目前尚无有效防治方法。本研究以感染BBTV的巴西蕉(MusaAAA Cavendish)为材料,研究了感染BBTV的巴西蕉离体再生和超低温保存技术条件,表明离体茎尖在MS+6-BA4.0 mg/L+NAA0.4 mg/L的培养基上分化不定芽较好;采用玻璃化法超低温保存技术保存带有BBTV的香蕉茎尖,再生后植株BBTV脱除率达到60.6%,而常规的茎尖培养对BBTV的脱除率仅为26.7%。

香蕉束顶病毒株系的研究

采自福建各地蕉区的不同香蕉束顶病毒株类型之间致病性和介体蚜虫的传病率有明显的差异，进一步依其在香蕉品种台湾蕉和Ｗｉｌｉａｍｓ上的反应、香蕉交脉蚜的传病率、毒株类型之间的交互保护和血清学测定结果等，把香蕉束顶病毒区分为ＢＢＴＶ－Ｓ（重型）和ＢＢＴＶ－Ｍ（轻型）两个株系。ＢＢＴＶ－Ｍ和ＢＢＴＶ－Ｓ均能引致香蕉叶片上的青筋症状，两者在血清学上有密切关系，但ＢＢＴＶ－Ｍ仅引致植株产生少量青筋，而ＢＢＴＶ－Ｓ除引致香蕉植株上有大量青筋之外，还引致严重矮化、束顶以及轻度黄化，ＢＢＴＶ－Ｍ的潜育期较ＢＢＴＶ－Ｓ明显长，香蕉交脉蚜对ＢＢＴＶ－Ｓ的传病率大大高于对ＢＢＴＶ－Ｍ的传病率。

香蕉束顶病流行学及综合防治技术研究

云南在50年代后期从越南、广东等地引进香蕉种苗后发生香蕉束顶病,至今由于大量从外省调入种苗已有三次大流行.现有香蕉栽培品种都感病.蕉园病株率平均每10天增加2.07%,5～7月为高峰期,三年后病害增长显著.病害流行与交脉好的发生有密切关系.本文报道了“区域防治、销毁病株、无病种苗、适时防蚜”的综合防治技术及具体实施方法.应用该技术在红河县500亩香蕉基地上示范,取得明显的防治效果和经济效益.

香蕉束顶病的研究 Ⅰ.病害的发生、流行与分布

香蕉束顶病广泛分布于福建省漳州、厦门、泉州、莆田、福州及龙岩等地(市)所辖的大部分县(市)的香蕉产区,达23个县(市、区)之多,分布北界已达福州,且有继续向西、向北推移之势。发病率因地区、年份不同以及是否采取防治措施等而有差异,从零星发病至30％—50％不等,严重者达70％-80％,甚至不得不毁园再植或改种其它作物。该病发生一般以4～6月份最烈,系发病高峰期。病害发生的轻重与品种类型、蕉苗质量、种植年限、生育龄期、蕉蚜数量、栽培管理措施、气候、土壤和地理位置等均有关系。大量种植带病蕉苗是病区迅速扩展的直接原因;介体蕉蚜活动猖獗和管理粗放是病害严重发生和流行的主导因素。

应用酶联免疫吸附测定技术检测香蕉束顶病毒

为探讨快速而准确的检测香蕉束顶病毒的方法，采用本所制备的香蕉束顶病毒（Ｂａｎａｎａｂｕｎｃｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ－ＢＢＴＶ）多克隆抗体ＩｇＧ和台湾的香蕉束顶病毒单克隆抗体２Ｈ６，用酶联免疫吸附测定技术（ＥＬＩＳＡ）双抗体夹心法（ＤＡＳ）测定了漳州市天宝的香蕉束顶病病株。试验结果表明，多抗和单抗相结合的ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法能检测到病组织汁液的最大稀释度为１∶６４０，而单独使用单抗的最大稀释度为１∶１０。同时采用多抗和单抗相结合的ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法比较了病株根、假茎、叶片中脉、叶肉的测定结果，假茎和中脉的病毒含量高于叶肉，根未检出。用此法能检测到蚜虫体内的病毒。

香蕉束顶病毒(BBTV)侵染对寄主内源激素的影响

本试验用ＥＬＩＳＡ方法测定了香蕉感染束顶病毒（ＢＢＴＶ）后植株体内的３种内源激素，赤霉素（ＧＡ３）、玉米素类（ｉＰＡｓ）和脱落酸（ＡＢＡ）的变化。结果表明，感株的ＧＡ３水平在侵染过程中虽有微弱增加，但含量和增长速度显著低于健株对照；ｉＰＡｓ在接种ＢＢＴＶ第１４天后明显下降，并维持较低水平；ＡＢＡ在ＢＢＴＶ侵染后被大量诱导增加并不断积累，在接种后第３５天测定含量最高，为对照的３．３４倍。试验还同时检测了ＢＢＴＶ在侵染过程中的运转。用间接ＥＬＩＳＡ测定的接种叶和顶叶的ＢＢＴＶ含量显示：接种２１天后ＢＢＴＶ在接种叶和顶叶中还大量增殖，呈系统性分布。但寄主的症状在接种３５天后才逐渐在顶叶表现。以上结果表明：香蕉束顶病的症状表现似乎主要与病株中的内源激素的失调有关。

香蕉束顶病的酶联免疫吸附检测

采用台湾的抗香蕉束顶病毒（BBTV）单克隆抗体和澳大利亚的抗血清,用酶联免疫吸附技术（ELISA）双抗体夹心法（DAS）测定了云南个旧市黄草坝的病株。结果表明,用此法能成功地检测到BBTV。同时比较了病株茎和叶片的测定结果,茎中的病毒含量高于叶片中的含量。

香蕉束顶病毒的寄主及其在病害流行中的作用

接种测定结果表明：香蕉、粉芭蕉和大蕉等是香蕉束顶病毒的寄主，但美人蕉、芋头、艳山姜、芭蕉芋、姜黄、长春花、甜瓜等其它２４种供试植物不是该病毒的寄主。研究结果还认为：在福建省香蕉产区，香蕉束顶病流行的主要侵染源为香蕉病株，而粉芭蕉和大蕉等病株则可在病区中病害的长期定殖和流行起重要的作用。本文还讨论了这些研究结果对该病害的流行学和防治的重要性。

BBTV两个株系DNA组分1的克隆及序列分析

对在生物学特性特别是寄主范围上存在明显差异的 NSP株系和 NS株系的代表分离物 (广州天河分离物和高州分离物 )的 DNA组分 1进行了克隆和序列分析 ,结果表明 :2个代表分离物的DNA组分 1全序列、ORF及其编码的氨基酸序列的变异率分别为 3.2 %、3.1%和 2 .8% ,从而进一步确证了可以用寄主范围来作上述 2个株系的鉴定。此外 ,这 2个株系的 DNA组分 1、ORF及其编码的氨基酸序列分别与肖火根等报道的中国 (广东 )分离物、以及亚洲组和南太平洋组各分离物进行比较 ,结果表明 :NS株系与肖火根等报道的中国 (广东 )分离物的亲缘关系很密切 ;这 2个株系与亚洲组各分离物的差异均较小 ,而与南太平洋组各分离物的差异均较大 。

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

[目的]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation pro-teins,Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。[方法]以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。[结果]应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b-Rep。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12%SDS-PAGE电泳分析,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。[结论]利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。

香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备

用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。

PCR法检测香蕉束顶病毒

用 3种方法 ,提取来自漳州的香蕉束顶病病叶组织中的 DNA,并以此为模板 ,用台湾大学及美国夏威夷大学的 4种引物进行 PCR检测 ,通过 2种反应成分、 3种循环参数的选择试验建立了 PCR反应体系 ,并发现用CTAB法提取到的模板 DNA无论质量、数量都较高 ,用于 PCR扩增 ,反应灵敏且效果好 ,可以从 5μg的香蕉病叶组织中检测到

香蕉束顶病毒DNA组分6的克隆和序列分析

The DNA component 6 of a Chinese isolate of banana bunchy top virus (BBTV) was cloned and sequenced. It is 1,081 nucleotides in length. Between the component sequences of Chinese and Australian BBTV isolates, there are 85.5% nucleotide sequence identity in full length, 92.5% nucleotide sequence identity in predicted open reading frame (ORF) and 94.8% amino acid sequence identity of potentially encoded proteins. The DNA component 6 is present in all BBTV infections tested, so it may have special function in transmission, infection, replication or movement of BBTV.

香蕉束顶病毒PCR检测技术研究

建立了聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术检测香蕉组织和单头蚜虫内的香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ），并报道了ＢＢＴＶ免疫捕捉ＰＣＲ（ＩＣ－ＰＣＲ）和直接结合ＰＣＲ（ＤＢ－ＰＣＲ）检测方法ＩＣ－ＰＣＲ和ＤＢ－ＰＣＲ分别能从４μｇ和０．

香蕉束顶病的研究 Ⅱ.病害的症状、传播及其特性

香蕉束顶病病株叶片边缘轻度黄化,略向上卷曲,叶背或叶片主脉背面和叶柄上出现断断续续的浓绿色条斑,即“青筋”,长短不一,短的不到1mm,长的尤其是叶片主脉和假茎上的可达30-50cm或更长,病后植株长出的叶片一片比一片小,病株外观矮化,呈束顶。病害的潜育期与侵染时蕉株大小和温度高低有关,最短的19d,最长的可达216d,病害由香蕉交脉蚜传播,最短获毒时间30min,最短接毒时间15min,循回期在ld左右,一次获毒后可保毒14d.带病吸芽也能传病。汁液摩擦和土壤不能传播。

工厂化组培香蕉分化芽中病毒的检测

采用间接ELISA法和PCR方法对组织培养的香蕉分化芽中黄瓜花叶病毒(CMV)、香蕉线条病毒(BSV)和香蕉束顶病毒(BBTV)分别进行了检测,用间接ELISA法抽检香蕉分化芽中的CMV,带毒率为2 5%左右;PCR法检测香蕉分化芽中BSV和BBTV,40个送检样品中带BSV的为12 5%,22个送检样品中未检测到带BBTV的香蕉分化芽.