蛋白质loop区域闭合数值方法分析与比较

针对蛋白质loop区域的闭合问题,比较分析了两种来源于机器人学的数值方法——循环坐标下降法(CCD)和雅可比矩阵方法,进行了实现并设计实验。在计算时间和闭合效率方面循环坐标下降法要明显优于雅可比矩阵方法,而雅可比矩阵方法则可以较平均地改变每一个二面角值。

删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高(R)-ω-转氨酶热稳定性

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。

亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸

亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E.coliBL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E.coliBL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。