荷花MYB蛋白靶基因NnTOM1的克隆及功能分析

【目的】从荷花(Nelumbo nucifera)中克隆NnTOM1基因,并进行生物信息学分析、基因表达模式分析以及烟草遗传转化,为进一步研究NnTOM1基因的功能奠定基础。【方法】通过克隆获得NnTOM1基因,对其蛋白序列进行理化性质和保守结构域预测等生物信息学分析,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析其组织特异性表达,并利用烟草遗传转化初步验证其生物学功能。【结果】NnTOM1基因编码区(Coding squence,CDS)长度为1191 bp,编码396个氨基酸,蛋白质分子式为C_(1918)H_(3130)N_(560)O_(589)S_(16),二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,含有TOM家族保守结构域(VHS-ENTH-ANTH和GAT),定位于细胞质中;多重序列比对及系统进化树分析表明,其与澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、蒂罗花(Telopea speciosissima)、博落回(Macleaya cordata)亲缘关系较近且序列一致性较高;qRT-PCR结果显示,NnTOM1基因在瓣化雄蕊中表达量最高,在根中表达量最低,且在重瓣型品种中表达量比单瓣型品种高;与野生型相比,NnTOM1转基因株系的花瓣颜色加深,花瓣先端变尖,花瓣间隔处加宽,花丝变长且明显长于花柱;且OE-1株系比野生型多出1片花瓣,表现出6片花瓣的表型。【结论】荷花NnTOM1基因可能参与荷花花器官的发育,为后续解析NnTOM1基因的功能提供了初步依据,也为荷花新品种选育提供了新的基因资源。

莲铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆和序列分析

用RT—PCR方法，从中国莲（Nelumbo nucifera）幼叶cDNA中成功扩增出铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）全长序列，并进行测序分析．该cDNA序列全长461bp，包括起始密码子和终止密码子．其中编码区段为456bp，共编码152个氨基酸，其编码蛋白的相对分子质量为1．552×10^4，等电点为4．515．与GenBank中其他物种的CuZnSOD进行同源性比较，发现其核苷酸序列相似性高达80％～86％，氨基酸序列相似性达89％～94％．所有已知的CuZnSOD的关键活性位点在该蛋白中均保守存在．将其与一些典型的单子叶和双子叶植物的该蛋白进行进化树分析，为富有争议的莲的系统学地位的确定，在分子生物学上为莲的系统学地位的确定提供了一个依据．该基因已在GenBank登记，序列号为DQ227345．

莲多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。它是许多果蔬等农产品酶促褐变的主因,也在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbonucifera)幼叶RNA中成功扩增出ppo的部分序列,经克隆测序,得到长度在978～1057bp的序列共7个,编码326～352个氨基酸。与其他物种PPO进行比较,其核苷酸序列相似性为83%～85%,氨基酸序列相似性为84%～99%。莲ppo的成功克隆为抑制莲藕的酶促褐变,提高莲的抗虫抗病性等的研究打下了良好的基础。

野生莲资源的RAPD分析

利用16个随机引物对来自6省的12份野生莲(Nelumbonucifera)资源材料进行了RAPD分析。扩增形成141条谱带,其中多态带79条,占56.03%。显示野生莲在我国具有丰富的遗传多样性。结果还表明:1)野生莲资源遗传分化十分明显,虽有一定的地域相似性,但有些地区的分化也很明显;2)野生莲资源可分为3类,与园艺学分类比较相似,可能暗示了现代莲由不同遗传背景的野生莲演化而来。

莲查尔酮合酶基因的克隆及序列分析

查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)是植物花色素苷等类黄酮化合物生物合成途径中的一个关键酶,而这些类黄酮化合物在花瓣中的含量可以改变花的颜色,所以CHS在植物中的表达量直接影响花的颜色。用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbonucifera)幼叶RNA中成功扩增出chs外显子2的部分序列,经克隆测序,得到长度在844bp￣936bp的序列共7个,编码282￣312个氨基酸。在GenBank中与黑核桃,山茶花,红杜鹃等其它物种CHS进行比较,其核苷酸序列相似性为82%￣83%,氨基酸序列相似性为86%￣97%。莲chs的成功克隆为莲的花卉基因工程研究等打下了良好的基础。

莲膨胀素基因的克隆及其序列分析

膨胀素是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以中国莲幼叶总RNA反转录所得的cDNA为模板,设计简并引物,用PCR方法成功扩增出expansin部分序列,经克隆测序,得到长度在531￣532bp的序列共3个,编码177个氨基酸,而且均存在expansin的保守区域。与其它物种,如杂交杨树、烟草、杂交葡萄、野马铃薯、樱桃等物种的expansin相比,核苷酸相似性为84%￣85%,氨基酸序列相似性为86%￣99%。莲expansin的成功克隆为研究莲的生长发育以及莲品种的改良等打下了良好的基础。

不同质量浓度多效唑对碗莲品种‘火花’生长和叶片部分生理指标的影响

研究了不同质量浓度(0~50 mg·L^(-1))多效唑对碗莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)品种‘火花’(‘Huohua’)生长的影响及多效唑处理过程中叶片部分生理指标的变化,并进行了隶属函数值分析和相关性分析。结果表明:质量浓度10~50 mg·L^(-1)多效唑处理抑制碗莲品种‘火花’生长。随着多效唑质量浓度提高,立叶数、立叶长、立叶宽、立叶高、花径、花高和开花总数总体上呈逐渐降低的趋势,且总体上与对照组(质量浓度0 mg·L^(-1)多效唑)差异显著。随着处理时间延长,质量浓度10~50 mg·L^(-1)多效唑处理组叶片中丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活性和多酚氧化酶(PPO)活性的变化趋势各异;质量浓度10~50 mg·L^(-1)多效唑处理组叶片中可溶性蛋白质含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,以及质量浓度10、20和30 mg·L^(-1)多效唑处理组叶片中过氧化氢酶(CAT)活性总体上呈先升高后降低的变化趋势,而质量浓度40和50 mg·L^(-1)多效唑处理组叶片中CAT活性则呈逐渐降低的变化趋势。相关性分析结果表明:碗莲品种‘火花’生长指标的隶属函数值间以及叶片中可溶性蛋白质含量和POD活性的隶属函数值与生长指标的隶属函数值间的相关性总体在0.05或0.01水平上显著。研究结果显示:质量浓度10、20和30 mg·L^(-1)多效唑处理可有效控制碗莲品种‘火花’生长,提高其观赏性;且其生长指标以及叶片中可溶性蛋白质含量和POD活性可以作为判断碗莲品种‘火花’矮化效果的可靠、简易指标。

千瓣莲品种资源的RAPD分析

千瓣莲是中国独特的荷花资源。为阐明其品种资源间遗传关系。利用16条随机引物对来自云南省的5份农家品种和湖北当阳玉泉寺的1份千瓣莲资源进行了RAPD分析。16条引物共扩增出141条谱带,其中多态带81条,占57.45%;6份千瓣莲之间遗传距离较远。千瓣莲在中国具有较丰富的遗传多样性,并存在较大遗传分化;玉泉寺千瓣莲品种与云南省品种之间没有明显遗传分化;云南省内地方品种间存在较大分化,其中姚安千瓣莲最特殊。

不同贮藏方式下莲藕理化特性的动态变化

以‘鄂莲5号’莲藕为试材,对其越冬期间根状茎在水藏、沙藏及室温贮藏方式下的可溶性糖、可溶性蛋白质、相对含水量、呼吸强度及多酚氧化酶(PPO)活性的动态变化进行分析.结果表明,莲藕的可溶性糖及蛋白质含量均呈现先上升后下降的趋势;PPO活性则一直上升,且贮藏后期室温贮藏下的PPO活性上升幅度显著高于沙藏和水藏;沙藏和水藏中呼吸强度在短期下降后逐渐上升,而室温下的呼吸强度则在快速上升后于贮藏后期迅速下降:3种处理对莲藕含水量的变化影响不大.沙藏和水藏与室温贮藏相比,可较好延缓莲藕的褐变腐烂.

藕莲种质资源形态与农艺性状的遗传变异分析(英文)

藕莲是莲(Nelumbo nucifera Gaertn.ssp.nucifera)的3种类型之一,在我国作为水生蔬菜栽培的历史愈两千年。对国家种质资源圃中来自17个省和直辖市的68份藕莲资源的19个形态和农艺性状进行了观察,并对其遗传变异进行了分析。结果发现整藕重与主藕重、主藕长和第三节粗成极显著正相关。通径分析结果表明主藕重对整藕重的正向效应最高(0.982)。主成分分析结果显示前4个成分占总变异的77.33%。结果还显示对整藕重负效应最高的是主藕重/整藕重(-0.296)。聚类分析发现所有藕莲资源可分为5组。

花莲种质资源形态性状多样性研究(英文)

对从国家种质资源圃中选取的40份花莲种质资源的19个形态性状进行了观察。结果发现花型、花瓣数、雌蕊是否瓣化、雌蕊瓣化程度和根茎颜色与花蕾形状呈显著正相关,其中花型、花瓣数和根茎颜色与花蕾形状呈极显著高度相关。通径分析表明现蕾期对花型有显著正向效应(0.552),其次是花瓣数(0.516)和根茎颜色(0.368)。与花型呈显著负相关的性状有花瓣长(-0.801)、现花期(-0.558)和叶宽(-0.451)。主成分分析显示前四个成分累计贡献率达65.68%。聚类分析将所有材料分为四组。

湘莲谷胱甘肽还原酶cDNA的克隆与分析

谷胱甘肽还原酶是植物体内一类重要的抗氧化酶.以湘莲叶片为材料,根据其它植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增到1个408bp大小的cDNA片段(Genbank注册号为AY781786),5`和3`RACE获得5`和3`端序列,全长1580bp,包含一个1140bp的开放阅读框架,编码380个氨基酸,与其它植物谷胱甘肽还原酶氨基酸序列的同源性在77%～92%之间.

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕"美人红"品种的GBSS基因的cDNA序列(GenBank登录号EU938541),其中开放阅读框(ORF)长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草(AJ006293)、马铃薯(EU403426)、大豆(EF153101)、水稻(EU735072)Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。

荷花NnXTH6基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】明确荷花(Nelumbo nucifera)木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglycosy-lase/hydrolase,XTH)的基因结构特征及在荷花花瓣不同发育时期的表达差异情况。探究NnXTH6基因对荷花花瓣发育和衰老的调控功能,以期为研究荷花花瓣生长和衰老的分子机制奠定理论依据。【方法】在荷花花发育转录组数据分析的基础上,利用已获得的荷花XTH基因序列,通过RT-PCR方法从荷花重瓣品种‘晚霞’(Nelumbo nucifera‘Wan xia’)中克隆得到NnXTH6基因序列,对基因结构和所编码蛋白质的理化性质进行生物信息学分析,并通过分析其亚细胞定位情况,以及在荷花不同花发育时期花瓣中的表达差异情况初步揭示基因功能。【结果】荷花NnXTH6基因序列完整开放阅读框(ORF)为870 bp,编码289个氨基酸,理论等电点为6.38,预测其相对分子质量为33.18 kD。NnXTH6蛋白质定位在细胞质中,与其他物种同源XTH蛋白进行的序列对比及系统进化树分析结果显示,荷花NnXTH6蛋白与本源植物荷花(Nelumbo nucifera)XTH蛋白的同源性最高(84.08%),与沉水樟(Cinnamomum micranthum)和芝麻(Sesamum indicum)的亲缘关系更近。实时荧光定量PCR结果表明,NnXTH6基因在初花时期(IF)的表达量远远大于喧蕾时期(SB)的表达量,在转色时期(CC)表达量最低,并且在谢花时期(FW)显著下调。【结论】荷花NnXTH6基因的表达随荷花的花发育时期的不同而变化,推测NnXTH6很大程度上参与调控了荷花的开花和衰老过程。

莲藕CBF2基因cDNA克隆及序列分析

目的:克隆莲藕CBF2基因的c DNA全长并对其进行序列分析。方法:根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,运用RACE技术克隆莲藕CBF2基因c DNA全长。结果:克隆得到全长为1 560bp c DNA序列,其中包括350bp的3'非编码区和124bp的5'非编码区及一个1 086 bp的完整开放阅读框,编码362个氨基酸,序列末端有poly(A)尾。其核苷酸序列与NCBI数据库中大豆DREB2C/CBF2、马铃薯DREB2A/CBF2、黄瓜DREB2A/CBF2及花生DREB2A/CBF2的同源性较高,分别为83%、77%、76%和76%,因此把该基因命名为Lr CBF2。氨基酸序列进化树分析表明该基因与葡萄相关基因亲缘关系较近。结论:分离克隆得到莲藕CBF2基因,为进一步研究莲藕中该基因的功能奠定基础。

荷花YABBY家族的全基因组和转录组分析

YABBY基因家族是种子植物特有的转录因子,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。为探究荷花YABBY基因家族的成员和作用,本研究对荷花YABBY基因家族进行了全基因组分析,鉴定到9个YABBY基因,共18个转录本,编码18个蛋白序列。根据系统进化树将其分类为5个亚族,均含有YABBY结构域和C2C2锌指结构域;共线性分析鉴定出4对共线基因。荷花YABBY基因含有顺式作用元件数量多少依次为光响应、激素诱导、逆境胁迫和植物生长发育,仅有NnYABBY3含有胚乳表达相关元件,推测其与莲子的发育有关。进一步对荷花花瓣、瓣化及非瓣化的雄蕊和心皮、荷叶、莲壳等组织的转录组数据分析发现,NnYABBY5、NnYABBY6和NnYABBY93个基因在心皮中特异性表达;NnYABBY3和NnYABBY9在幼嫩叶片中高表达,在成熟叶片中不表达;NnYABBY8在非瓣化雄蕊和非瓣化心皮不表达,而在花瓣、瓣化雄蕊和瓣化心皮中均有表达,推测NnYABBY8可能与雄蕊和心皮瓣化有关;NnYABBY3在心皮和莲壳中的表达量显著高于其他组织,推测NnYABBY3与莲子的发育有关。这些结果表明荷花YABBY基因具有调控荷花生长发育的潜在应用价值,为进一步研究荷花YABBY基因功能提供参考和理论基础。