利用Loxp/Cre重组酶体系构建脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠模型

香叶草基合成酶(Geranylgeranyl bisphosphate synthase,GGPPS)与囊泡运输过程中小G蛋白的翻译后修饰密切相关。文章选择同时具有2个Loxp位点基因和GGPPS基因的Ggpps-floxed小鼠与带有脂肪组织特异性启动子aP2的Cre小鼠aP2-Cre进行杂交,以获得脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠Ad Ggpps KO。经过基因鉴定和多组织的定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)以及Western blot确认,得到的小鼠模型的脂肪组织GGPPS缺失。

基于Cre/Loxp系统的Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠的构建及效率检测

目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Western blot分析EYFP对不同组织以及不同组织CD45^(+)细胞中CSF1R的标记效率。结果获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠。此外,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP可有效标记小鼠组织CSF1R以及不同部位中CD45^(+)细胞。与R26R^(EYFP)组比较,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP标记效率最高的是脑组织(P<0.001),最低的是胸腺组织(P<0.05),脾脏组织则差异无统计学意义。结论成年Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠是获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)诱导型条件性荧光小鼠的有效途径。Csf1r-Cre^(ERT2)介导EYFP可对小鼠不同部位CSF1R以及CD45^(+)细胞中CSF1R进行有效示踪。

利用Cre-Loxp技术构建标记肝星状细胞的小鼠模型

目的通过Cre-Loxp技术构建转基因小鼠,应用Lrat^(Cre)工具鼠示踪肝星状细胞分布。方法将Lrat^(Cre)小鼠与H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠交配,通过PCR鉴定得Lrat^(Cre)H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠。固定小鼠肝脏切片,借助免疫荧光标记肝脏非实质细胞抗体,通过Imaris 3D还原分析肝星状细胞和其他肝脏非实质细胞间的表达与分布,以及进行肝星状细胞的自定位检验。结果Lrat^(Cre)介导的红色荧光蛋白tdTomato的表达可以特异性标记肝星状细胞,并通过肝星状细胞与肝脏巨噬细胞、肝窦内皮细胞的免疫荧光定位为细胞间相互作用分析提供了途径。结论Lrat^(Cre)可以介导tdTomato对肝星状细胞进行示踪,同时可用做肝星状细胞特异性的报告基因工具鼠。

基于Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性突变NLRP3转基因小鼠模型

目的应用Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性NLRP3点突变转基因小鼠模型并对其进行鉴定。方法利用Cre-LoxP技术,构建NLRP3基因T346M点突变的flox杂合子(NLRP3^(flox)/+)小鼠。将该小鼠与广谱表达Cre重组酶工具鼠(CAG-Cre/ERT2,CreT)杂交繁育,获得基因型NLRP3^(flox)/+CreT^(+/-)小鼠,后者与NLRP3 T346M的flox纯合子(NLRP3^(flox)/flox)小鼠进一步交配获得NLRP3^(flox)/flox CreT^(+/-)(KI/KI)和NLRP3^(flox)/+CreT^(+/-)(KI/WT)小鼠,于6~8周时经他莫昔芬的诱导实现NLRP3 T346M突变基因的时间特异性敲入。小鼠繁育和鉴定过程中,用PCR方法检测鼠尾基因组DNA。采用Western blot法检测小鼠肝脏和心脏中NLRP3、pro-Caspase-1和Caspase-1的蛋白质表达水平。结果小鼠给予他莫昔芬后,NLRP3 T346M突变基因被诱导敲入。Western blot结果显示,KI/KI小鼠肝脏和心脏组织以及KI/WT小鼠心脏中NLRP3炎性小体效应蛋白Caspase-1的表达水平较同窝野生型小鼠显著上调。结论本研究基于Cre-LoxP技术成功构建了NLRP3 T346M突变转基因小鼠模型,该模型小鼠在他莫昔芬诱导后可出现自发性的NLRP3炎症小体活化,这为探究NLRP3炎症小体活化机制以及筛选和评价NLRP3炎症小体抑制剂提供了新的时间特异性的实验动物模型。

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。

基于Cre-LoxP系统的B细胞特异性荧光报告基因小鼠模型的构建及鉴定

目的应用Cre^(-)LoxP重组酶系统构建B细胞特异性表达tdTomato蛋白的荧光报告基因小鼠。方法在Gt(ROSA)26Sor(Rosa26)位点插入1个由CAG启动子驱动的报告基团,其LoxP侧翼设计有STOP盒,可阻止tdTomato荧光蛋白表达,经与CD19-Cre工具小鼠交配繁殖获得tdTomato^(CD19-Cre)小鼠,Cre重组酶特异性识别LoxP序列,删除STOP盒,从而使B细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白。利用PCR进行基因型鉴定。通过流式细胞术和脑膜免疫荧光分别检测野生型对照组小鼠和tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脾和脑膜B细胞中tdTomato红色荧光蛋白表达。结果基因型为tdTomato^(F/-)CD19-Cre^(+)或tdTomatoF/FCD19-Cre^(+)的小鼠为B细胞特异性表达tdTomato天然红色荧光蛋白的荧光报告基因小鼠。而对照组小鼠基因型为tdTomato^(F/-)CD19-Cre^(-)或tdTomatoF/FCD19-Cre^(-)。流式细胞术测定结果表明,与野生型对照组小鼠相比,tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脾中表达tdTomato荧光蛋白的B细胞百分比均显著增加(P<0.01);在非B细胞群中仅检测到少量的tdTomato+细胞。且在滤泡型B细胞、边缘区B细胞、T1 B细胞、T2 B细胞和成熟B细胞等B细胞亚群细胞表面tdTomato荧光蛋白均能稳定表达(P<0.01),百分比分别为(88±8)%,(80±9)%,(86±9)%,(92±6)%和(89±7)%。通过与CD45共定位,在tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脑膜中也检测到tdTomato红色荧光蛋白表达。结论成功构建B细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白的荧光报告基因小鼠模型,且tdTomato荧光蛋白可在外周免疫器官和中枢神经系统稳定表达。

Cre/loxP系统应用于毕赤酵母基因敲除的研究进展

毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一,蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代,高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段,其中由Cre/loxP系统介导的基因改造技术受到了科研人员的广泛关注。综述了Cre/loxP系统的基本原理、应用于毕赤酵母基因敲除的技术路线及其关键的技术问题。

Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价

选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP).经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系.将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选(FACS)、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1%,DNA水平的删除效率则达到97%.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据.

一种利用Cre/loxP系统进行标记基因删除与靶基因置换的细胞模型研究(英文)

Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中'友好位点'的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究.首先构建了两个载体:a.整合载体pTE-lox2272-DsRed-loxP-GFP-loxP,含有红色荧光标记基因DsRed和绿色荧光标记基因GFP;b.置换载体pT-lox2272-neo-loxP,含有筛选标记基因neo,用以置换DsRed基因.然后,用整合载体转染SHZ-88细胞,并随机挑取了3个同时表达DsRed和GFP的稳定整合细胞克隆.随后用置换载体和Cre表达载体PBS185对以上每个克隆分别进行了3次共转染,通过G418筛选并扩增培养后,总共获得1070个克隆.通过分析标记基因DsRed和GFP在这些克隆中的表达情况:Cre介导的删除效率为91.1%,定点置换效率为29.3%.最后对部分克隆进行了PCR和DNA印迹鉴定,分子鉴定结果与发光的表型状况一致.这一方法为Cre/lox系统在转基因家畜生产中的进一步应用提供了实验依据.

Cre/loxP位点特异性重组系统在植物中应用的研究进展

Cre/loxP位点特异性重组系统自发现以来,在植物基因重组领域得到了广泛应用,已成为提高转基因植物安全性的有效方法。本文介绍了该系统的基本概况及其在转基因植物表达载体构建方面的应用,尤其是在基因删除、定点整合、多基因表达以及杂种优势利用等方面的应用做了重点阐述。

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA(+)/nptⅡ(-)/Cre(-)的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%～46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率(144.44%)也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.

基于Cre/loxP重组系统的多基因载体构建及烟草转化研究

利用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR和Southern blot检测发现,多基因已成功转入烟草基因组中;经半定量RT-PCR检测证实,4个基因均能正常表达。

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件。方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系。结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础。

利用Cre/loxp技术构建血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠

目的:利用Cre/loxp条件性基因敲除技术构建血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究cdc42在维持微血管屏障中的作用提供研究平台。方法:将引进的cdc42flox/flox小鼠和血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后两种小鼠进行杂交,并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Cdc42flox/+Cre+的小鼠即为本实验所构建的血管内敲除/-cdc42基因杂合子小鼠。结果:从引进这两种小鼠开始繁殖5个月,共繁殖cdc42flox/flox小鼠40只,取其21只进行鉴定,均为cdc42flox纯合的子小鼠。血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠和野生型C57小鼠杂交后繁殖,共得到子代小鼠36只,其中表达Cre重组酶的小鼠17只,基因型为cdc42flox/flox与表达Cre重组酶的杂合子小鼠杂交并繁殖,得到基因型为Cdc42flox/+Cre+的小鼠10只,基因型为Cdc42/-flox/+Cre-13只。这/-两种基因型小鼠其身高、体重无明显差异。结论:本研究利用Cre/loxp技术成功构建了血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠,为进一步构建血管内敲除cdc42基因小鼠奠定基础,为在整体动物水平研究cdc42在维持微血管屏障中的作用提供研究平台。

Cre/Loxp和四环素系统在基因可控表达中的应用

本文介绍了目前最常见的四环素调控系统和Cre/LoxP系统的基本原理、应用情况、近年来的研究进展总结,比较了两种系统的优缺点,介绍了两种系统联合应用的成果,并且提出了Cre/Loxp系统在HPV11全基因组定向表达中的应用,并由此提出利用Cre/Loxp系统解决多个基因定向表达问题的设想。

应用Cre/loxp系统构建含有BAC序列的重组伪狂犬病毒

近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。

基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立

目的构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg(EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果成功构建了基于Cre-LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL/6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg(EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5~15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论成功建立运用Cre-LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。

Cre/loxP位点特异性重组系统及其在口腔医学领域中的应用

Cre/loxP位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxP位点组成。Cre重组酶可识别loxP位点并催化2个loxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。该系统作用方式简单、重组效率高,可定时、定位地对基因进行修饰,已成为一种定向改变生物活体遗传信息的重要的试验工具。本文主要就Cre/loxP系统的结构、重组机制、特点及其在口腔医学领域中的应用作一综述。