敲除大肠杆菌Lpp基因对动脉粥样硬化的抑制作用研究

为探究大肠杆菌Lpp基因敲除对动脉粥样硬化作用,取8周龄ApoE^(-/-)小鼠分为Control组、Chow_Lpp^(+/+)(C_Lpp^(+/+))组、Chow_Lpp^(-/-)(C_Lpp^(-/-))组、Western Diet_Lpp^(+/+)(W_Lpp^(+/+))组和Western Diet Lpp^(-/-)(W_Lpp^(-/-))组,每周灌胃3次,持续16周后,取小鼠心脏与主动脉;油红及H&E染色主动脉及心脏,观察脂质沉积及炎性变化。研究结果显示,成功构建了动脉粥样硬化小鼠模型;相较于W_Lpp^(+/+)组,W_Lpp^(-/-)组动脉粥样硬化斑块的面积显著减少;小鼠主动脉根部脂质及炎性细胞浸润程度显著降低。这表明敲除Lpp基因后的大肠杆菌对小鼠动脉粥样硬化具有缓解作用。

大肠埃希菌CLM37菌株Lpp基因敲除及胞外表达N-糖基化重组蛋白研究

目的·构建外膜脂蛋白Lpp(Braun's lipoprotein)基因缺失的大肠埃希菌菌株,在该菌株中进行大肠埃希菌胞外生产N-糖基化重组蛋白研究。方法·利用Red同源重组系统,敲除大肠埃希菌CLM37基因组上的外膜脂蛋白Lpp基因;通过绘制生长曲线,研究Lpp基因缺失后对大肠埃希菌生长状态的影响。将受体蛋白表达载体pIG6-rFn3-Gly和空肠弯曲杆菌来源的N-糖基化基因簇载体pACYCpgl共转化大肠埃希菌CLM37?Lpp,研究大肠埃希菌胞外生产N-糖基化重组蛋白情况。结果·获得了Lpp基因缺失的大肠埃希菌菌株CLM37?Lpp,并在该菌株中成功实现了胞外生产N-糖基化重组蛋白rFn3-Gly;相比于菌株CLM37,大肠埃希菌CLM37?Lpp胞外生产重组蛋白rFn3-Gly的总量约提升了4倍,糖基化效率约提高了6倍。结论·成功构建大肠埃希菌菌株CLM37?Lpp并实现了胞外生产N-糖基化重组蛋白r Fn3-Gly,提高了糖蛋白产量及糖基化效率。

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础。方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和W estern b lot鉴定。结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上。W estern b lot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应。结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达。

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法,为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA,用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入到表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料,制备层析柱,将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％;纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E.coli TB1中能够高效表达;用多糖树脂作为填充料,进行亲和层析的方法,具有良好的纯化效果。

转LpP5CS和LpP5CSF128A基因烟草耐盐及抗旱性分析

利用农杆菌介导法,将多年生黑麦草Δ′-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因LpP5CS和该酶第128位苯丙氨酸变异为丙氨酸的突变基因LpP5CSF128A转入烟草,获得转基因表达植株。在NaCl和自然干旱处理下,对多年生黑麦草的野生型基因LpP5CS和突变基因LpP5CSF128A的抗逆生理功能进行初步研究,通过测定脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量和T1代烟草幼苗耐盐性鉴定,进一步证实LpP5CS和LpP5CSF128A过表达的转基因烟草植株,其耐盐性和抗旱性得到了明显改善,转LpP5CSF128A植株的胁迫耐性要强于转LpP5CS植株。

幽门螺杆菌lpp20基因在食品级乳酸菌中的表达及免疫活性鉴定

目的:构建分泌表达幽门螺杆菌lpp20基因的重组乳酸乳球菌菌株,并鉴定其免疫活性,为研究安全高效的幽门螺杆菌口服疫苗奠定基础。方法:采用PCR法从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增lpp20基因,将lpp20先与T载体(p MD19-T)连接,进而经双酶切与表达载体p NZ8149-SPusp45连接,用电穿孔法将重组质粒转入食品级乳酸乳球菌菌株NZ3900中,并用Nisin诱导Lpp20表达,表达产物通过Western blot法鉴定免疫活性。结果:lpp20基因的PCR扩增产物大小约为540 bp,重组质粒的酶切、PCR和测序鉴定结果符合预期;在菌体和培养基中均检出表达的Lpp20蛋白,重组表达的Lpp20蛋白相对分子质量约为20 000,且具有与小鼠抗幽门螺杆菌血清反应的免疫活性。结论:成功构建了能够分泌表达幽门螺杆菌Lpp20抗原的乳酸乳球菌菌株,该重组菌株在口服疫苗研究中具有应用潜力。

幽门螺杆菌1pp20基因在大肠杆菌TB1中诱导表达方法的研究

目的 :研究影响幽门螺杆菌lpp2 0基因在大肠杆菌TB1中表达的因素 ,探索高效表达的条件 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的纯化和生产奠定基础。方法 :用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp2 0基因片段 ,将目的基因插入的表达载体pMAL c2X中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliTB1)。采用不同的诱导时间、IPTG浓度和诱导温度进行诱导表达 ,应用SDS PAGE方法对表达产物进行分析。结果 :在诱导 1～ 4h之间 ,融合蛋白的表达量变化较为显著 ,而 4～ 8h之间则无显著变化 ;IPTG终浓度低于 0 .2mmol/L或高于3 .2mmol/L均能显著减少融合蛋白的表达量 (P <0 .0 5 ) ,而IPTG终浓度在 0 .4～ 2 .4mmol/L之间时 ,对融合蛋白的表达量并无显著影响 ;诱导温度在 3 0℃～ 40℃之间变化对融合蛋白的表达量无显著影响 ,超出此范围可使表达量显著减少 (P <0 .0 5 ) ;在优化诱导条件后 ,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白的 3 4%。结论 :通过调整诱导时间、IPTG浓度和诱导温度 ,lpp2 0基因与载体pMAL c2X的重组质粒在E .coliTB1中能够高效表达。

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。