牛支原体脂蛋白LppB的多克隆抗体制备及对天然蛋白识别分析

旨在克隆牛支原体脂蛋白LppB基因,并进行原核表达与纯化,制备其多克隆抗体,研究其对天然蛋白的识别能力。以牛支原体PG45、ZYJ5及GT01株基因组DNA作为模板,PCR扩增LppB基因,测序并比对分析;将合成的pET-30a-LppB质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达产物用Ni-NTA纯化,Western blot方法验证纯化重组蛋白,测定其反应原性;将纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其ELISA效价,Western blot测定多克隆抗体对牛支原体LppB的识别。结果显示:PCR扩增的LppB基因全长约1860 bp,与预期大小相符;LppB主要为可溶性表达,大小约为74 kDa,经Ni柱纯化后获得纯化蛋白,LppB蛋白具有良好的反应原性;制备出小鼠抗LppB多克隆抗体,ELISA效价为1∶25600,能够识别天然LppB蛋白。本研究成功制备出牛支原体重组LppB蛋白及其多克隆抗体,为LppB功能研究奠定基础。

丝状支原体丝状亚种SC型LppB基因的克隆与表达纯化

目的克隆丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)LppB蛋白基因,并进行表达及纯化。方法通过PCR,扩增MmmSC标准株PG1的LppB全基因,克隆至pMD18-T载体上,并测序鉴定。同时选LppB基因中两个TGA之间903bp片段,与pET30a载体构建重组质粒,进行诱导表达,表达产物经Ni-NTA-His系统纯化。结果PCR扩增的LppB基因长度片段约1869bp,与预期大小相符。将其与NCBI上发布的Afade株、LC型代表株Y-goat和同属的Bovine7株的LppB基因序列相比较,同源性分别为99·8%、92·8%和76·7%,氨基酸同源性分别为99·2%、90·2%和67·0%。经Ni-NTA-His系统纯化,得到纯净的单一蛋白。结论已成功克隆了PG1的LppB蛋白基因,并进行了表达及纯化。

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。