HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究

目的建立H IV-1 Tat蛋白结合Tar的抗H IV-1药物筛选模型用于抗H IV药物筛选。方法构建表达H IV-1Tat蛋白的真核表达质粒(pCDNA3.1(+)-Tat)和H IV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因,采用脂质体转染法共转染HeLa细胞,荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况,建立H IV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型,用于抗H IV-1的药物筛选。以DRB(5,6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑)为阳性对照,进行模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明,目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。

生物发光人肝癌裸小鼠原位癌模型的构建

目的选用稳定表达荧光素酶报告基因的人源性肝癌细胞株(HCCLM3-Luc),构建人肝癌细胞株原位癌荷瘤裸鼠动物模型。方法活体成像仪定量分析不同细胞数量HCCLM3-Luc的荧光强度表达情况,并检测各细胞数量的荧光素酶活性,探索HCCLM3-Luc荧光素酶产生的光子量与肿瘤细胞数量之间的线性相关性。采用肝叶原位接种HCCLM3-Luc瘤块组织和尾静脉注射HCCLM3-Luc细胞悬液,分别构建人肝癌裸小鼠原位癌模型;比较两种方法构建人肝癌细胞株原位癌裸鼠模型的可行性,并优化模型构建中的关键因素。结果HCCLM3-Luc细胞数量的成正相关,(相关系数R^2=0.9989,直线方程式:Y=1155.8X+1×10^6),平均ROI值约为每个细胞140光子/s。采用肝叶原位接种组的原位瘤成瘤率[(82.5±7.2)%]明显高于尾静脉注射[(34.1±13.2)%]。结论本课题构建了生物发光人肝癌细胞株原位癌裸鼠模型,该模型可采用小动物成像仪实时监测肿瘤生长情况。

基于GADD153-LUC的重组人肺上皮细胞快速检测痕量PM_(2.5)致DNA损伤效应

目的:利用重组人体肺上皮细胞(BEAS-2B)快速检测细颗粒物(PM_(2.5))导致的DNA损伤效应。方法:制备不同浓度的PM_(2.5)并作用于重组肺上皮细胞,观察不同浓度条件下MTS(内盐法,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑内盐法)检测重组人肺上皮细胞细胞生存率、彗星实验检测DNA损伤、RT-PCR检测GADD153-luc基因表达变化、荧光素酶发光检测DNA损伤情况。结果:相比于阴性对照,25、125μg/mLPM_(2.5)可诱导重组细胞活性显著下降和DNA损伤显著增加,相比于阴性对照,5、25、125μg/mL PM_(2.5)可诱导重组细胞内源性GADD153mRNA基因表达、荧光素酶活性显著增加,且GADD153mRNA基因表达、荧光素酶活性具有良好的相关性(r^(2)=0.992,P<0.01)。结论:相比传统细胞DNA损伤的方法,基于GADD153-LUC的重组人肺上皮细胞可快速检测更痕量PM_(2.5)所致DNA损伤效应。

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）的长末端重复序列（ＬＴＲ）含有病毒的启动子，调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ一Ｌｕｃ，该质粒能在Ｅｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性，从而证明ＢＩＶＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。Ｍｕｎｇｂｅａｎ核酸酶作图分析发现，ＢＩＶＬＴＲ在Ｅｃｏｌｉ中的转录起始位点位于Ｕ_３区，而不是在真核细胞中的Ｕ＿３一Ｒ交界处。同时我们也证实了ＢＩＶＬＴＲ在Ｅ，ｃｏｌｉ中仍可被ＢＩＶｔａｔ蛋白特异性地反式激活，为研究ｔａｔ蛋白的作用机制提供了一条新的途径。

萤火虫萤光素酶基因构建BIV－LTR启动子表达研究体系

萤火虫萤光素酶基因构建ＢＩＶ－ＬＴＲ启动子表达研究体系刘国文，纪永刚，梁臣，刘淑红，陈启民，耿运琪（南开大学生命科学学院天津３０００７１）关键词萤光虫萤光素酶基因（ｌｕｃ），ＢＩＶ－ＬＴＲ，ＢＩＶ－ｔａｔ目前使用最广泛的报道基因是细菌的氯霉素乙酰转移...

基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因快速验证系统的建立

旨在建立一种准确且快速的基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因验证系统,为研究水稻miRNAs的生物学功能奠定基础。已有研究证实osa-miR169o剪切靶基因OsNF-YA4(LOC_Os03g48970.1)的mRNA,以此为参照,在烟草和水稻原生质体瞬时表达系统中将miR169o前体基因分别与LUC表达载体、LUC-48970和LUC-48970m3融合表达载体瞬时共表达,通过CCD活体成像和Luminometor分析了共表达后LUC活性的动态变化。利用茎环qRT-PCR对miR169o的表达水平进行分析,获得靶基因验证的适合体系。在水稻原生质体体系中,LUC活性和miR169o表达水平在原生质体转化后逐渐增高;24 h时LUC活性最高,相应miR169o表达水平上升10倍左右。综合分析,在原生质体转化后24 h-36 h为适宜检测时间段。在烟草瞬时表达体系中,农杆菌注射72 h后LUC活性最强,而miR169o的表达在48 h后即可上调20倍。因此,农杆菌注射后48 h-72 h为适宜检测时间段。本系统为水稻miRNA靶基因的验证提供了一种简便、快速,且更接近于体内真实情况的实验方法。

萤火虫Luc基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆野生型虫荧光素酶(luciferase)基因(Luc)全长序列并对其进行生物信息学分析。[方法]以虫荧光素酶报告栽体pXP2 DNA为模板,应用PCR技术,获得萤火虫Luc基因目标条带并克隆到pGEM-T-Easy载体,利用CD search、ProtParam、ProtScale和SOMPA等11种预测软件对其保守区域、一级结构、理化性质、空间结构及活性区域等进行预测分析。[结果]该酶由551个氨基酸残基组成,属于可溶性亲水蛋白。其二级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成。三级结构以6q2m.1的A链为模板进行同源建模,其活性区域由125个氨基酸残基构成,面积和体积分别为2 483.879A^2和1 834.454A^3。在该蛋白质的活性区域之外,筛选出38个具备引入二硫键条件的潜在位点。[结论]成功克隆了Luc基因,并对野生型虫荧光素酶进行了生物信息学分析预测,为进一步过定点突变提高虫荧光素酶的热稳定性奠定了理论基础。

菠萝U6启动子克隆及活性分析

单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的“指挥中心”,可以引导Cas9对DNA进行定点编辑,其转录能力直接影响基因编辑效率。U6启动子常用于驱动sg RNA的表达,尤其是本物种内源U6启动子通常具有更高效的启动效率。为了筛选出菠萝内源高效转录活性U6启动子,提升菠萝CRISPR/Cas9基因编辑效率,本研究从菠萝基因组中克隆了5个内源U6启动子,选择水稻3个U6启动子,构建驱动萤火虫荧光素酶基因(firefly luciferase,LUC)的融合表达载体,瞬时转化本氏烟草叶片,通过检测生物化学发光活性,比较各个启动子的转录活性。研究结果表明:从菠萝基因组克隆出5个U6启动子分别命名为:AcU6-1P、AcU6-2P、AcU6-3P、AcU6-4P、AcU6-5P;生物化学发光信号检测发现5个AcU6均具有转录活性,其中AcU6-2P启动子驱动LUC表达的荧光信号最为强烈,其次为AcU6-5P启动子;生物化学发光活性分析发现AcU6-2P启动子驱动产生的荧光素酶活性最高,AcU6-5P仅次于AcU6-2P,结果与荧光信号一致。综上,从菠萝基因组中筛选出2个具有高效转录活性的内源U6启动子AcU6-2P和AcU6-5P,可为后续菠萝CRISPR/Cas9基因编辑系统的优化和分子育种提供了依据。

健腰密骨片对成骨细胞增殖分化和BMP信号通路报导基因活性的影响

目的:探讨健腰密骨片对成骨细胞的影响及作用机制。方法:常规培养转染12×SBE-OC-Luc报导基因的成骨细胞株OCT-1细胞(以下简称12×SBE-OC-Luc-OCT1细胞),采用健腰密骨片含药血清进行干预48 h,并以骨形态发生蛋白(BMP)2纯化蛋白(50 ng/ml)为阳性对照。用MTT法检测成骨细胞增殖率,实时荧光定量RT-PCR法检测成骨细胞中Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen)、骨钙素(osteocalcin)和BMP2mRNA的表达以及荧光素酶活性检测法检测成骨细胞12×SBE-OC-Luc的活性。结果:与正常对照组比较,健腰密骨片能明显促进成骨细胞的增殖(P<0.05);显著增加成骨细胞中typeⅠcollagen、osteocalcin和BMP2的mRNA表达量(P<0.05);能明显促进成骨细胞中BMP报导基因12×SBE-OC-Luc的荧光素酶活性(P<0.05)。结论:健腰密骨片可通过促进BMP2、typeⅠcollagen和osteocalcin的表达及BMP信号通路报导基因12×SBE-OC-Luc的活性,从而促进成骨细胞的增殖与分化。

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1(+)表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1(+)-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16~20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R;大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10^(5)个·mL^(-1),rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^(-1),1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.00)%、(94±2.24)%、(99±2.68)%、(94±3.03)%,RSD均小于4%。结论:本研究利用转基因细胞成功建立rhFSH-Fc生物学活性测定方法,该方法操作简便,重复性好,准确性高,可用于rhFSH-Fc产品的常规检测。