液相色谱方法分析茜草中遗传毒性成分Lucidin及其苷

目的:对茜草药材中是否含有有毒成分lucidin及其苷lucidin-3-O-primeveroside(EKU-4)进行初步研究。方法:分别采用RP-HPLC,HPLC-DAD,LC-MS对6份不同来源茜草药材进行了定性检测。结果:各个药材中均能检测到EKU-4信号;②,⑤,⑥号药材中检测到Lucidin信号。结论:茜草中含有遗传毒性成分EKU-4。

茜草中Lucidin,Lucidin-3-O-primeveroside及大叶茜草素在小鼠血浆中代谢趋势的初步研究

目的:研究中药茜草中遗传毒性成分Lucidin及其苷Lucidin-3-O-primeveroside(EKU-4)在动物体内的代谢,对茜草的用药安全性进行初步考察。方法:采用反相高效液相法测定茜草70%乙醇提取物以及ig该提取物一定时间的动物血浆样品。结果:茜草提取物中均能够检测到Lucidin、EKU-4及大叶茜草素;茜草70%乙醇提取物,经ig给药后,血浆样品中仅能检测到Lucidin及大叶茜草素,并且给药15 min,Lucidin的血药浓度达到最高,给药后30 min,大叶茜草素的血药浓度达到最高。结论:由于ig给药前后血浆中未检测到EKU-4,而Lucidin成分有增加的趋势,因此推断中药茜草中EUK-4成分可能分解为Lucidin的形式参与动物体内代谢。

醋红大戟的质量标准研究

对醋红大戟的质量标准进行全面研究,为制定该品种的《山东省中药饮片炮制规范》标准提供技术支撑。在《山东省中药饮片炮制规范》2012年版醋红大戟质量标准的基础上,收集红大戟样品29批次,醋制加工后,对醋红大戟的性状、水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、显微、薄层、含量测定进行了系统研究和分析,制定相关限度。在原有标准基础上增加了显微鉴别项、芦西定含量测定项,修订了浸出物项,完善了该饮片的质量标准。该研究确定了醋红大戟的质量控制指标,所建立的质量控制方法操作方便、重复性好、结果准确,可用于控制醋红大戟的质量。

茜草与欧茜草的化学成分研究 Ⅱ.反相高效液相色谱法测定茜草素和芦西定的含量

采用ＲＰ—ＨＰＬＣ法，对茜草（Ｒｕｂｉａｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）和欧茜草（Ｒ．ｔｉｎｃｔｏｒｕｍ）中所含蒽醌类成分茜草素（ａｌｉｚａｒｉｎ）和芦西定（ｌｕｃｉｄｉｎ）进行含量测定．２种成分的平均回收率分别为９８．１％和１０１．４％，ＲＳＤ分别为４．０％和５．７％．

液相色谱-质谱法测定茜草中芦西丁含量

目的运用液相色谱-质谱法测定茜草药材中芦西丁的含量。方法采用Agilent1290HPLC-G6460三重四级杆质谱仪，在ESI-离子模式下选择离子监测，色谱分离采用AgilentEclipsePlusC18RRHD色谱柱（2.1mm×50mm，1.8μm），以0.1%甲酸-乙腈（70∶30）为流动相，柱温30℃，流速0.4mL/min，进样量2μL。结果芦西丁在0.0052～2.64ng范围内呈良好线性关系（r＝0.9999），80%、100%、120%浓度水平的加样回收率为94.80%～100.94%（平均97.17%，RSD＝6.16%），方法重复性及精密度均良好。结论本研究建立的方法灵敏、准确，重复性好，适用于茜草中芦西丁的含量测定，可用于茜草药材中该成分的限度检查。

HPLC法同时测定云南红大戟中三种蒽醌类化合物的含量

目的:建立HPLC法同时测定红大戟药材中芦西定、5-羟基巴戟醌与红大戟素的含量。方法:采用Waters Xbridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以0.05%磷酸为流动相A,以乙腈为流动相B,梯度洗脱;流速为1.0 ml·min^(-1),检测波长为280 nm,柱温为30℃。结果:芦西定、5-羟基巴戟醌、红大戟素的线性范围分别为0.147~29.400μg·ml^(-1)(r=0.999 6)、0.126~25.200μg·ml^(-1)(r=0.999 9)、0.135~27.000μg·ml^(-1)(r=0.999 5),平均加样回收率分别为98.50%(RSD=1.20%)、98.72%(RSD=0.73%)、101.10%(RSD=1.12%)(n=6)。结论:本文建立的方法经方法学验证可用于评价红大戟药材质量。

基于液相色谱-质谱技术的芦西丁-DNA加合物快速筛查研究

目的建立基于液相色谱-三重四级杆质谱(LC-QQQ-MS)及液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)技术的DNA加合物通用型“发现-确证”分析策略,研究茜草中潜在遗传毒性物质芦西丁(lucidin,Luc)与3种2′-脱氧核苷的直接反应性和代谢反应性,筛查和确证可能的Luc特异性DNA加合物。方法采用与DNA加合物具有相同质谱碎裂模式的3种2′-脱氧核苷,建立和优化三重四极杆质谱中性丢失和伪中性丢失扫描模式下未知DNA加合物的非靶向筛查方法,以及高分辨数据依赖性扫描模式下的加合物靶向确证方法。将Luc与2′-脱氧核苷在Ⅰ相代谢激活和未激活条件下分别孵育,筛查生成的特异性DNA加合物,再通过特征性质谱碎裂离子进行结构验证。结果优化后的伪中性丢失扫描对脱氧核苷脱糖基的检测灵敏度可达pg·mL^(-1)级别。在Luc与脱氧核苷体外孵育模型中,发现并确证了6种Luc-DNA加合物,包含2种2′-脱氧胞苷(dC)加合物、2种2′-脱氧腺苷(dA)加合物、2种2′-脱氧鸟苷(dG)加合物,并对其结构进行了表征。Luc-DNA加合物的生成随着Luc暴露量、暴露时间的增加而升高,存在显著的剂量-反应、时间-反应关系,且该种结合无需代谢激活即可发生。结论所建立的DNA加合物“发现-确证”策略灵敏度高、准确性好,能够提供分子水平上加合物的结构信息,适用于评估Luc暴露所致的DNA损伤,为其毒性机理研究和再评价提供了有力数据支持,也为中草药中潜在遗传毒性成分快速筛查提供了重要的方法参考。

基于多组分含量测定及多元统计分析研究茜草、大茜草及大叶茜草

目的:建立多组分含量测定并结合多元统计分析,研究茜草与大茜草、大叶茜草,以期找出三者的成分差异,为茜草的鉴别提供研究基础。方法:以ACE Excel 5 C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱,以甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长为250 nm,进样量为10μL,柱温为30℃。对24批茜草饮片、10批大茜草和8批大叶茜草进行茜素、芦西定、异茜草素、羟基茜草素、6-羟基甲基异茜草素、大黄酚、大叶茜草素7个成分的含量测定,并将测得结果通过聚类和偏最小二乘法(PLS-DA)进行分析评价。结果:建立了茜草、大茜草与大叶茜草的多组分含量测定方法,测得7个成分的质量分数分别为:0.0004%~0.0376%、未检出~0.0492%、0.0010%~0.0169%、0.0034%~0.0525%、0.0028%~0.0869%、0.0023%~0.0186%、0.0595%~0.2988%;通过聚类分析与偏最小二乘法(PLS-DA)均可将茜草聚为1类,大茜草聚为1类,大叶茜草聚为1类。结论:通过多组分含量测定,应用聚类分析、偏最小二乘法(PLS-DA)可区分茜草与大茜草、大叶茜草。此方法的建立为茜草的质量控制及评价提供了分析方法和数据支撑。

茜草色素光泽汀与DNA相互作用机理的研究

在p H 7.41的生理条件下,以溴化乙锭(EB)作为光谱探针,采用紫外可见光谱和荧光光谱等方法对茜草色素光泽汀(Luc)与DNA的相互作用机理做了初步探讨。同时还研究了光泽汀对DNA分子的热变性以及粘度影响。在碘化钾(KI)效应实验中,以碘化钾作为荧光猝灭剂探讨光泽汀与DNA分子之间的相互作用方式。循环伏安法法研究光泽汀在玻碳电极上的电化学规律,根据循环伏安曲线及溴化乙锭对光泽汀与DNA作用的影响,推断光泽汀与DNA主要作用方式为嵌插。结果显示:光泽汀与DNA之间相互作用的结合比为n(Luc):n(DNA)=2:1,Luc-DNA复合物的表观摩尔吸光系数ε=8.12×104 L/(mol·cm)。在光泽汀存在的条件下,DNA分子的热变性温度和粘度都会增加,并且在碘化钾效应实验中可降低碘化钾的荧光猝灭效应,同时Luc的电化学变化规律同EB相似。在本实验条件下,光泽汀与DNA分子之间的相互作用方式存在嵌插。

光泽汀体内遗传毒性风险评价

目的评价光泽汀小鼠体内的遗传毒性。方法C57BL/6J小鼠分为溶剂对照(0.5%CMC-Na)组、茜草素(200 mg·kg^(−1),结构对照)组、乙酰基亚硝基脲(ENU,40 mg·kg^(−1),阳性对照)组、甲基磺酸乙酯(EMS,200 mg·kg^(−1),阳性对照)组和光泽汀低、中、高剂量(100、200、300 mg·kg^(−1))组,溶剂、光泽汀和茜草素连续7 d ig给予,给药第1天记为D1,阳性对照ENU和EMS分别连续3 d给予,均每天给药1次。于D7、D56采集约0.5 mL外周血用于血清生化检测;于D14、D28、D42、D56采集外周血开展Pig-a基因突变试验;末次给药后采集肝、肾细胞开展彗星试验,分析每只动物至少100个细胞的尾DNA百分含量;末次给药后制备骨髓细胞样本,计算嗜多染红细胞的微核发生率。解剖后取心、肝、脾、肺以及肾脏进行组织病理学检查。结果试验期间所有动物一般症状未见明显异常,各组动物体质量未见明显差异,未见与给予受试物有关的组织病理学改变。光泽汀低、中、高剂量组及EMS组肾脏尾DNA百分率均显著高于溶剂对照组(P<0.05、0.001),光泽汀高剂量组及EMS组肝脏尾DNA百分率与溶剂对照组比较显著增加(P<0.05、0.001)。光泽汀与茜草素的小鼠骨髓微核试验、Pig-a基因突变试验均为阴性。结论100~300 mg·kg^(−1)光泽汀未见对小鼠整体产生明显毒性。光泽汀可导致小鼠肝、肾细胞DNA损伤,肾细胞DNA损伤程度更为严重。

芦西丁在不同种属肝微粒体和肝S9中Ⅰ相代谢及Ⅱ相磺酸化代谢的稳定性考察

目的:采用4个种属体外肝微粒体和肝S9孵育体系评价芦西丁Ⅰ相代谢、Ⅱ相磺酸化代谢稳定性,比较其体外代谢的种属差异。方法:建立并验证了基于超高效液相色谱-高分辨质谱法(UHPLC-HRMS)的芦西丁定性、定量检测方法,将芦西丁与大鼠、小鼠、比格犬、人肝微粒体和肝S9分别进行孵育,考察其代谢稳定性参数、代谢产物和代谢途径。结果:在Ⅰ相和Ⅱ相磺酸化孵育体系中,芦西丁代谢的肝清除率大小排序为小鼠>大鼠>比格犬>人,在大鼠、比格犬、人肝微粒体和肝S9中,其代谢稳定性均良好,而在小鼠肝微粒体和肝S9中,分别表现为代谢不稳定和代谢稳定性中等;在4个种属中快速识别了5个代谢产物,其中Ⅰ相氧化产物3个,Ⅱ相磺酸化产物2个,代谢产物的生成速率与代谢稳定性结果较为一致。结论:建立的UHPLC-HRMS简便、专属性强,可用于芦西丁的代谢稳定性和代谢产物研究。芦西丁Ⅰ相和Ⅱ相磺酸化的体外代谢稳定性、代谢产物生成速率存在明显的种属差异,其在人、大鼠、比格犬中的代谢特征较为相近,可为芦西丁体内代谢研究、安全性评价及动物模型选择提供参考依据。

茜素型蒽醌基因突变风险评价

目的使用毒性预测软件及细菌回复突变(Ames)试验评价茜素型蒽醌的基因突变风险。方法通过毒性软件Toxtree、Derek Nexus和Sarah Nexus对茜素型蒽醌:茜草素、异茜草素、甲基异茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、茜素-1-甲醚、羟基茜草素、光泽汀进行致突变风险预测;每个受试物设置5个给药浓度,分别在有或无S9代谢活化条件下,使用5种鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA100、TA102、TA1535和TA1537开展基于6孔板培养的Ames试验,判断该类化合物苯环上不同取代基对致突变性的影响。结果软件基于蒽醌环的存在预测该类化合物均具有致突变风险。在非S9代谢活化下,异茜草素和羟基茜草素可导致TA1537回复突变菌落数增加;光泽汀可诱导TA97、TA100和TA1537回复突变菌落数增加。在S9代谢活化下,异茜草素可导致TA97、TA100和TA1537回复突变菌落数增加;羟基茜草素可导致TA1537回复突变菌落数增加;光泽汀可导致TA97、TA100和TA1537回复突变菌落数增加;甲基异茜草素可导致TA97、TA100、TA102和TA1537回复突变菌落数大幅增加;甲基异茜草素-1-甲醚可导致TA100回复突变菌落数增加。结论茜素型蒽醌受试物在有或无S9代谢条件下表现出不同程度、不同菌株的回复突变,开展相关研究评价其毒性风险对该类化合物合理监管具有重要价值。

茜素型蒽醌化合物体外Pig-a基因突变性试验研究

目的对具有相同母核结构的7种茜素型蒽醌化合物开展体外Pig-a基因突变试验,分析不同茜素型蒽醌化合物取代基结构与其致突变性的关联。方法小鼠淋巴瘤细胞L5178Y(tk+/--3.7.2.C)分别与系列浓度的茜草素、异茜草素、甲基异茜草素、羟基茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、茜草素-1-甲醚和光泽汀作用4 h(有S9)或24 h(无S9),给药24 h后应用细胞计数仪进行计数,计算细胞相对倍增速率(RPD)评价受试物细胞毒性;细胞培养8 d后经APC-anti-CD45和PE-anti-CD90.2抗体孵育后,使用流式细胞仪检测细胞突变(CD45+CD90.2−)率。结果所有受试物在有或无代谢活化条件下所设浓度组RPD均大于50%,未见明显细胞毒性作用,可排除试验中假阳性结果。在无S9代谢活化条件下,光泽汀(16μg·mL^(−1))组、羟基茜草素(10μg·mL^(−1))组、甲基异茜草素-1-甲醚(31.25μg·mL^(−1))组Pig-a基因突变率与溶媒对照组比较显著升高(P<0.05、0.01、0.001);在有S9代谢活化条件下,光泽汀(4、8μg·mL^(−1))、羟基茜草素(10μg·mL^(−1))、茜草素-1-甲醚(3.75、15.00μg·mL^(−1))、甲基异茜草素(12.5、25.0、50.0、100.0μg·mL^(−1))、甲基异茜草素-1-甲醚(15、30、60μg·mL^(−1))、异茜草素(2.50、5.00μg·mL^(−1))组Pig-a基因突变率与溶媒对照组比较显著升高(P<0.05、0.01、0.001)。结论羟基取代基所在位点是茜素型蒽醌化合物致突变性强弱的决定性因素,其体内致突变性有待进一步确证。