基于细胞膜色谱技术的鹿角胶肽段筛选及鉴定

利用细胞膜色谱/超高相液相色谱-质谱(CMC/UPLC-MS)方法对中药饮片鹿角胶中的有效成分进行筛选,结合Maxquant软件、Perseus软件以及Uniprot数据库对所得谱图进行数据分析,使用Protein Data Bank对分析结果进行结构鉴定,同时采用生物信息学平台对这些肽段的生物活性、不良反应、相对分子质量、等电点、不稳定指数等基本分子特性进行预测。鉴定肽段活性概率为0.09,无毒,无溶血性,有致敏性,相对分子质量为1541.68,肽链长度为14,亲水性为良好,等电点值为3.92,不稳定性指数为34.39。该方法为快速筛选鉴定具有药理作用的多肽和蛋白质等活性成分提供了一条可行的研究思路。

鹿角胶体内分布及入血入骨成分的示踪动力学分析

背景:课题组前期研究发现鹿角胶小分子肽能够促进骨生长,对于治疗骨类疾病具有良好的应用前景。然而鹿角胶如何在体内发挥作用以及原理尚未明确。目的:荧光标记及活体示踪技术研究鹿角胶体内靶器官分布动向。方法:使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)对鹿角胶进行荧光标记,通过荧光成像、紫外光谱扫描检测标记结果。将标记成功的鹿角胶,通过灌胃注入小鼠体内,通过激光共聚焦显微镜检测鹿角胶吸收入血情况,应用小动物活体成像仪检测鹿角胶在小鼠体内的分布情况。在血清及骨内荧光最强时间点取材,对血清及骨组织蛋白液进行凝胶电泳,通过二级质谱检测确定吸收入靶器官的鹿角胶成分。结果与结论:①葡聚糖凝胶色谱成功分离荧光标志物,荧光成像及紫外光谱扫描证明标记成功,并测得FITC-鹿角胶的荧光取代度为0.953%;②入血成分荧光强度检测结果显示口服2 h后鹿角胶在血清中分布最多;③不同时间小鼠的双侧股骨与胫骨荧光成像显示相同,证明鹿角胶可通过入骨发挥作用;④二级质谱检测对比UniProt数据库发现该肽段为核心蛋白聚糖的特征片段,证明鹿角胶中的核心蛋白聚糖可进入骨内发挥疗效。

周青教授从“虚、滞、瘀”辨治精索静脉曲张性不育经验

精索静脉曲张性不育即精索静脉曲张(varicocele,VC)所导致的男性不育,为男科常见疾病。周青教授提出从虚、实两端来认识本病的发生:“虚”为先天肾水与后天脾土出现虚损后,其所生之精不能濡养精索静脉、所化之气不能升发精索静脉内血液;“实”则包括“滞”“瘀”两方面,肝气郁滞不能疏通血脉,即为“滞”,而“虚”“滞”可导致精索静脉内血行迟缓,凝而为“瘀”,局部血管因此出现扩张,影响睾丸正常功能,最终导致不育发生。“虚、滞、瘀”相互影响,合而为病。治疗上,周青教授倡导虚、实同调,主张益肾生精、健脾升阳疗其虚,行气活血、化瘀通滞治其实。针对临床常见的肾虚血瘀型精索静脉曲张性不育,自拟益肾填精、活血化瘀之龟鹿桃红方施治,疗效明显。

桔梗等中药微量元素初探

对中药桔梗、怀牛膝、华山参。鹿角胶、龟甲胶及阿胶进行了微量元素研究。结果发现：同一种中药因产地不同，其微量元素的含量不同。同一种植物药，其部位不同，所含微量元素多少不等。同一类型的中药，其品种、来源不同，微量元素的含量高低也不相同。本研究为今后对这些中药进行真伪鉴别，合理开发或综合利用都提供了科学的依据。

固相萃取-液质联用法用于乌鸡白凤丸中动物药的质量控制初探

目的:建立乌鸡白凤丸中鹿角胶、鹿角霜和鳖甲的鉴别和掺伪检查方法。方法:采用胰蛋白酶对乌鸡白凤丸样品酶解处理,利用固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱(SPE-UPLC-QQQ)对样品中的鹿、鳖、猪、牛、马、驴、角鳖、佛罗里达鳖源性成分的专属性特征离子进行检测。结果:方法的专属性、精密度和灵敏度均符合分析检测的技术要求。12批样品检测到了处方中规定的鹿、鳖源性成分,部分样品也检出了处方中未规定的猪、牛源性成分。结论:所建立的方法经方法学验证,专属性强,为乌鸡白凤丸的质量控制及标准研究提供了参考。

论鹿角霜炮制方法的变迁

对鹿角霜炮制方法的历史沿革进行了探讨。鹿角霜产生于隋代,在唐代仍未引起重视。宋代随着鹿角胶使用的增加,鹿然霜开始进入医家视野。元代创立了鹿角霜炮制的基本法式。明代进一步改进了其炮制的工艺,完善了其药性理论。清代对鹿角霜的炮制工艺进行了反思,认为鹿角霜应该将胶质留在霜中,并重新定义了鹿角霜的概念。建国以来历版《中华人民共和国药典》中关于鹿角霜的认识与明代的炮制理念相同。认为现代鹿角霜研究应注意:(1)鹿角霜应为胶霜的复合体;(2)应开展胶霜合用工艺的比较研究;(3)应重新定义鹿角粉与鹿角霜;(4)鹿角霜应入丸散剂;(5)应进一步探讨煮霜过程中的热水频添工艺原理。

金刚健骨片对去卵巢模型鼠细胞因子影响的实验研究

目的观察中药制剂金刚健骨片对绝经后骨质疏松症细胞因子的影响。方法将 1 4月龄SD雌性大鼠摘除双侧卵巢常规喂养 3个月制成骨质疏松症模型 ,随机分为模型空白组、金刚健骨片高剂量组、低剂量组、骨松宝组、尼尔雌醇组 ,并设假手术组作对照。分别给药和喂养 3个月后 ,断头取血 ,分离血清 ,测定白细胞介素 -6 (IL -6 )、肿瘤坏死因子 (TNF)含量。结果金刚健骨片、骨松宝、尼尔雌醇均可减少IL -6、TNF的产生 ,抑制骨质疏松症的病理进程。结论金刚健骨片具有抗细胞因子的作用 ,从抗细胞因子入手研究防治骨质疏松症具有重要意义。

郑邦本常用对药举隅

郑邦本老师常用黄芪60 g配伍益母草15～30 g治疗肾病综合征、肾炎综合征、慢性肾炎、糖尿病肾病;灵芝30 g配刺五加15 g对脾肾阳虚,体虚乏力,食欲不振,腰膝酸痛,失眠多梦等证尤为有效,常用于疲劳综合征、神经衰弱的治疗;苏子10 g配地龙10 g降气止咳平喘,常用于支气管哮喘、喘息性支气管炎的治疗;木香10 g配伍槟榔10 g行气宽肠,治疗腹胀、肛门坠胀疗效显著;益母草15～30 g配生山楂30 g活血通经,治疗月经量少、痛经、不孕症等;半枝莲30 g与垂盆草30 g清热利湿退黄,退黄与降酶并举,常用于治疗肝功能异常湿热证;血肉有情之品鹿角胶10 g配伍骨碎补15 g补肾强筋骨,用于骨质疏松、骨折术后愈合不佳、脑萎缩等病;穿山甲5～10 g配鹿角片5～10 g治疗乳腺增生、输卵管不通疗效显著;怀牛膝15 g配刘寄奴30 g治疗血瘀阻络引起的关节疼痛,用于风湿性关节炎、膝骨性关节炎、骨关节损伤疾病。上述对药为郑老师经过长期临床验证,效如桴鼓,具有可重复性,如能在辨证基础上正确运用,常能收到良好效果。

鹿角胶治疗血细胞减少的临床研究

【目的】探讨鹿角胶的中医辨证疗法在血细胞减少患者中的临床疗效。【方法】选取126例血细胞减少病例，按入院先后顺序分为观察组86例和对照组40例，对照组施行基础治疗，观察组在基础治疗的同时服用鹿角胶，治疗6个月后对两组总有效率，症状积分，血常规，血T细胞亚群CD3＋，CD4＋，CD4＋／CD8＋比值进行比较。【结果】观察组的总有效率为88．3％，显著高于对照组的65．0％，差异有统计学意义（P〈0．05）；两组在治疗后症状积分均比治疗前显著下降，且观察组症状积分显著低于对照组（P〈0．05）；两组外周血白细胞、血红蛋白、血小板和网织红细胞比治疗前显著升高，且观察组各项指标明显高于对照组（P〈0．05）；与治疗前相比，两组患者治疗后CD3＋，CD4＋水平，CD4＋／CD8＋比值均显著升高，CD8＋水平显著降低（P〈0．05）；且观察组CD3＋，CD4＋水平，CD4＋／CD8＋比值均显著高于对照组，CD8＋水平显著低于对照组（P〈0．05）。【结论】鹿角胶结合西医常规疗法治疗血细胞减少可提高治疗总有效率，改善症状。

《中华人民共和国药典》收载的鹿源药材中γ-氨基丁酸含量分析

目的对《中华人民共和国药典》收载的鹿源药材中γ-氨基丁酸进行含量分析。方法采用柱前衍生UPLC-PDA法对不同基原、形态、采收时期,不同加工方式和部位鹿茸及鹿源药材中γ-氨基丁酸进行含量分析。结果鹿茸、鹿角、鹿角胶和鹿角霜中γ-氨基丁酸含量差异有统计学意义(P<0.05),以鹿茸(0.35-2.91 g/kg)最高,鹿角胶(0.71-0.94 g/kg)其次,鹿角和鹿角霜含量(0-0.13 g/kg)最低;不同基原鹿茸中γ-氨基丁酸含量以花鹿茸最高;不同形态鹿茸中γ-氨基丁酸含量以二杠最高,三岔其次,毛桃最低;不同生长阶段鹿茸中γ-氨基丁酸含量以二茬茸最高,激素催生二茬茸最低;不同加工方式及部位对鹿茸中γ-氨基丁酸含量影响较大,煮炸与冻干相比能较大程度保留鹿茸中的γ-氨基丁酸,单位质量排血茸中γ-氨基丁酸含量显著高于带血茸(P<0.05),蜡片、粉片、纱片和骨片中γ-氨基丁酸含量逐渐递减。结论γ-氨基丁酸在鹿源药材中广泛存在且差异显著,尤其在不同基原、形态、采收时期,不同加工方式和部位鹿茸中,可以考虑将γ-氨基丁酸作为鹿源药材的质量控制成分。

不同因素对鹿角胶品质的影响

目的研究加热温度、加热时间与p H值对鹿角胶品质的影响。方法采用质构仪、分光测色仪测定不同条件下鹿角胶的凝胶强度及颜色。结果鹿角胶的凝胶强度随着加热温度升高、时间延长,逐渐降低;随p H值的升高呈先增大后减小的趋势,p H为8时达到最大;鹿角胶的外观颜色在p H值为7~9,加热时间0~4 h内变化较小。结论鹿角胶生产或加工中应控制各项生产因素,保证产品的质量。

HPLC-DAD同时测定左归丸药液中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸含量

目的:建立同时测定左归丸药液中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸5种化学成分含量的分析方法。方法:采用HPLC-DAD多波长切换-梯度洗脱技术。色谱柱:Eclipse XDB-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:甲醇-1%醋酸水溶液,梯度洗脱;流速:1.0 m L·min^(-1);分别以各成分的最大吸收波长为检测波长;柱温:30℃。结果:左归丸药液中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸5种成分均具有良好的线性关系(r≥0.999),平均加样回收率为97.76%~101.8%(RSD<3%,n=6)。3批样品中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸含量分别为0.489 0~0.500 6、0.104 4~0.108 4、0.048 56~0.050 66、1.042~1.061、5.287×10-3~5.369×10^(-3) mg·m L^(-1)结论:该方法经方法学验证,可用于左归丸药液及其制剂的质量控制。

温阳补肾药对骨髓间充质干细胞促增殖的实验研究

目的:观察、比较巴戟天、鹿角胶、淫羊藿、骨碎补对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)促增殖的影响,探讨其作用机理。方法:建立SD大鼠BMSCs体外培养体系,倒置显微镜、苏木精-伊红染色进行形态学观察;流式细胞仪(FCM)进行BMSCs细胞周期分析;MTT法检测BMSCs生长曲线;4味温阳补肾药含药血清配制,确定其最佳药物浓度和最佳血清浓度对BMSCs促增殖的影响。结果:体外培养大鼠BMSCs经倒置显微镜、苏木精-伊红染色的形态学观察均符合BMSCs的形态及生长特点。高、中、低剂量的四味中药含药血清对F3BMSCs 24、48、72h的增殖效应显示,以中剂量组20%含药血清对F3BMSCs 48h后促增殖最明显,其组间比较结果为淫羊藿>骨碎补>鹿角胶>巴戟天。结论:巴戟天、鹿角胶、淫羊藿、骨碎补四味温阳补肾药均有促BMSCs增殖作用。淫羊藿促BMSCs增殖效果最佳,其组间比较结果为淫羊藿>骨碎补>鹿角胶>巴戟天。

差示扫描量热法用于胶类中药饮片及配方颗粒的鉴别研究

目的建立简便快捷的差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)用于鉴别不同胶类中药饮片及配方颗粒。方法采用DSC法,样品粒度100目,以铝坩埚为参照物,氮气为气氛,流速100 ml/min,考察最佳升温范围和升温速率。以优化后的DSC试验条件,鉴别42批次的阿胶、鹿角胶、龟甲胶饮片及配方颗粒。结果 DSC试验最佳升温范围30~500 ℃,升温速率30 ℃/min。DSC谱图显示,阿胶饮片、鹿角胶饮片、龟甲胶饮片分别有4、3、2个特征峰,且三者特征峰峰形、位置均有明显不同;鹿角胶配方颗粒与龟甲胶配方颗粒均有2个放热峰数,但两者特征峰位置不同,阿胶配方颗粒只有1个放热峰。鹿角胶的中药饮片及配方颗粒在325 ℃左右共同出现一放热峰,可作为鹿角胶的特征峰。结论 DSC法具有操作简便、用量少、无需试剂、测量快速、重现性好、谱图易解析等优点,可通过DSC谱图中特征峰数量、位置、峰形和焓值大小等快速鉴别区分各种胶类饮片及配方颗粒。

《中华人民共和国药典》收载的鹿源药材中胶原蛋白对比分析

目的:研究《中华人民共和国药典》收载的鹿源药材中胶原蛋白含量,以期为鹿源药材的质量评价和控制提供理论依据。方法:参考GB 5009.5-2016方法,通过杜马斯燃烧法测定鹿源药材中蛋白质含量,折算系数为6.25;在NY/T 1618-2008方法基础上做略微改动,采用氨基酸自动分析法测定鹿源药材中4个构成胶原蛋白的氨基酸含量,进而折算胶原蛋白含量,折算系数为10。结果:梅花鹿的鹿茸、鹿角、鹿角脱盘、鹿角胶、鹿角脱盘胶、鹿角霜和鹿角脱盘霜中的胶原蛋白含量分别为391.0、157.0、159.8、716.4、735.0、12.2和13.2 mg·g-1;马鹿的鹿茸、鹿角、鹿角脱盘、鹿角胶、鹿角脱盘胶、鹿角霜和鹿角脱盘霜中的胶原蛋白含量分别为382.4、154.6、157.1、708.8、714.3、10.9和12.8 mg·g-1。结论:鹿源药材中胶原蛋白含量以鹿角胶最高,鹿茸其次,鹿角次之,鹿角霜最低。鹿源药材中4个构成胶原蛋白氨基酸和胶原蛋白含量差异很大,可以考虑以羟脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和胶原蛋白含量作为鹿源药材的质量评价标准。

基于超声辅助酶解与串联质谱联用的鹿角特征肽检测

目的检测鹿角特征肽类成分,为鹿角、鹿角胶及其相关产品的质量研究提供实验依据。方法通过超声辅助酶解的方法,快速酶解鹿角、鹿角胶样品。采用高效液相色谱-三重四极杆质谱对酶解液进行检测,在电喷雾离子化的正离子模式下,采用多反应监测,以鹿角特征肽m/z 765.5→554.4、m/z 850.4→515.4、m/z 864.0→535.4、m/z 858.7→527.4、m/z 612.2→464.2、m/z 845.0→507.3为离子对,检测鹿角、鹿角胶及掺伪样品的鹿角特征肽。结果该方法可在1 h内完成鹿角相关样品特征肽类成分的检测,可用于鹿角与鹿皮样品的区分以及掺伪鹿角样品的检测。结论采用超声辅助酶解与质谱联用的方法快速、准确、专属性强,可用于鹿角相关样品的快速精准检测。

2015年版《中华人民共和国药典》收载的鹿源药材中硫酸软骨素含量分析

目的:研究2015年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)收载的鹿源药材中硫酸软骨素的含量差异。方法:采用稀碱-浓盐法提取,硫酸软骨素ABC酶酶解样品中的硫酸软骨素,应用高效液相色谱法对样品中的总硫酸软骨素及硫酸软骨素A、B、C含量进行测定;色谱条件:Hypersil SAX强阴离子硅胶色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以2 mol·L^(-1)的氯化钠溶液(盐酸调pH至3.5)和水(盐酸调pH至3.5)为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),检测波长232 nm,柱温40℃。结果:梅花鹿鹿茸、鹿角(鹿角脱盘)、鹿角胶(鹿角脱盘胶)、鹿角霜(鹿角脱盘霜)中硫酸软骨素含量分别为2.06、0.46(0.42)、0.93(1.10)、0.22(0.17)g·kg^(-1);马鹿鹿茸、鹿角(鹿角脱盘)、鹿角胶(鹿角脱盘胶)、鹿角霜(鹿角脱盘霜)中硫酸软骨素含量分别为1.83、0.41(0.34)、0.91(0.87)、0.19(0.15)g·kg^(-1)。结论:《中国药典》收载的鹿源药材中硫酸软骨素的含量差异很大,鹿茸中的最高,鹿角胶、鹿角、鹿角霜中的依次递减。

基于HS-SPME-GC-MS分析阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶蛤粉烫炮制前后挥发性成分变化

目的分析探讨蛤粉烫对阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶挥发性成分的影响。方法采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶、其炮制品及原料中的挥发性成分进行分析,并结合相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)法分析其中的关键香气成分。结果驴皮、龟甲、鹿角、阿胶、龟甲胶、鹿角胶、阿胶珠、龟胶珠、鹿胶珠的挥发性成分中分别鉴定出36、40、54、39、36、34、48、54、38种化合物。阿胶、阿胶珠中的杂环类、烷烃类、醇类相对含量最高,龟甲胶、龟胶珠中的酯类相对含量最高,鹿角胶、鹿胶珠中的醛类相对含量最高,3种动物胶经蛤粉烫后,成分相同变化趋势为烷烃类含量均升高,醇类、醛类含量均下降,共有成分2-戊基呋喃、戊醛、己醛、正辛醛含量均下降,2,6,10-三甲基十四烷、壬醛含量均升高。ROAV法确定了3种动物胶、胶珠的5种共有关键香气成分,分别为戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、壬醛。结论3种动物胶在蛤粉烫前后,挥发性成分变化存在一定的共性和个性联系,该结果可为动物胶的蛤粉烫炮制研究提供参考。

鹿角胶特征肽段的发现及专属性验证研究

目的找到鹿角胶正品来源梅花鹿、马鹿中区别于易掺伪品种驯鹿、驼鹿的特征肽段并验证专属性。方法使用鹿角胶样品,处理得到肽段混合物进入纳升液相色谱-高分辨质谱联用仪(nano HPLC-orbitrap fusion)分析,获得目的蛋白质全肽段质谱图。使用PEAKS8.5软件对质谱数据进行分析,进行肽段混合物的从头测序以及肽段序列的匹配,得到的数据通过比对找到特征离子对,确定特征肽段序列并合成,使用液相-三重四级杆质谱联用多反应检测(MRM)方法验证特征肽段专属性。结果共找到梅花鹿、马鹿专属的2个特征离子对,对应2条特征肽段,专属性验证结果好。结论找到的2条肽段可以作为鉴别梅花鹿与马鹿鹿角胶的特征肽段,并提供了一条特征肽段研究策略,为鹿角胶新的鉴别及含量测定方法奠定基础。

鹿胶的本草考证

鹿胶,历史上有2种来源,包括鹿皮胶与鹿角胶,现代以鹿角胶为主,鹿皮胶仅贵州、吉林等民间使用。该文对鹿胶自周朝《周礼·冬官·考工记》以来的古今文献进行梳理,经系统的本草考证,发现①古代鹿胶为六胶(鹿胶、马胶、牛胶、鼠胶、鱼胶、犀胶)之首,除作为黏合剂用于制弓、制墨外,入药成为主流应用,鹿角胶以"白胶"之名入药,始载于东汉《神农本草经》。②因鹿皮的历代用途多样化、贵族化及鹿角获得的便利性等原因,古代鹿胶的制备原料由鹿皮与鹿角并重逐渐演变为以鹿角为主,鹿皮退出主流原料。③鹿胶的基原动物为鹿科马鹿Cervus elaphus、梅花鹿C.nippon外,古代还涉及同科其他动物如麋鹿Elaphurus davidianus、水鹿C.unicolor。④鹿胶加工方法从古代延续至今,未发生显著的变化。⑤鹿皮胶与鹿角胶功效同中有异,均性温,鹿角胶温补肝肾,益精养血,偏于补阳;鹿皮胶既能补阳,又可滋阴补血、止血,实为阴阳双补,具有独特优势。该文的考证结果可为鹿皮胶的推广及药用价值开发提供文献支撑。