Luman-N端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。

甲状旁腺激素和转铁蛋白N端半分子融合蛋白在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术将PTH(parathyroidhormone,甲状旁腺激素)基因与TFN(transferrinN_terminalhalf_molecule,转铁蛋白N端半分子)基因在体外融合,融合基因克隆至真核表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母GS115。转化子经甲醇诱导后,融合蛋白得到了表达并分泌到发酵上清液中。经SPSepharoseFF阳离子交换层析、PhenylSepharoseFastFlow疏水层析纯化获得了纯度大于95%的PTH_TFN样品。Westernblot分析及腺苷酸环化酶实验证明融合蛋白中的PTH具有与抗PTH抗体结合能力及刺激腺苷酸环化酶的活性,铁饱和实验证明融合蛋白中的TFN和单独的TFN具有相同铁结合能力。因而TFN可望作为PTH的天然运输载体。

Ssp dnaB蛋白质内含子介导的精氨酸激酶N末端结构域的表达

采用聚合酶链式反应(PCR)扩增精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)N端基因片段,经双酶切后连接至含有蛋白质内含子Ssp DnaB基因的质粒载体pTWIN1中,将Ssp dnaB和N-domain的融合基因利用双酶切手段重组到含有组氨酸标签(His-tag)的质粒载体pET-28a中,得到含有组氨酸标签的融合蛋白基因,并在大肠杆菌Rosetta中表达,为获得具有天然氨基酸序列的精氨酸激酶N端结构域打下基础。

Ⅱ型葡萄糖异构酶N端随机卷曲序列的嫁接效应

木糖/葡萄糖异构酶(xylose/glucose isomerase,XIase/GIase)是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶(TTGIase)N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的I型葡萄糖异构酶(TFGIase)的N端,构建了融合蛋白NTFGIase。发酵实验结果显示,在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%;酶学检测结果显示,N-TFGIase比酶活较TFGIase高出26%,最适温度较TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适p H较TFGIase降低1.0。序列分析表明,TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。实验结果提示,将来自超嗜热菌的Ⅱ型XIase/GIase的N端随机卷曲序列融合到I型XIase/GIase N端,能够提高后者的热稳定性、酸稳定性和表达效率等酶学性质,与我们的预测结果相一致,这为酶的分子改造和生产应用提供了参考。

HIV-1 Gag P17m的融合表达、纯化及NMT有效底物

利用PCR技术扩增编码HIV 1GagP17m的DNA片段 ,进而构建了T7启动子控制下的C端His Tag融合表达质粒pMF P17mHT .SDS PAGE分析结果表明 ,融合蛋白 (约 2 1kD)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中得到高表达 ,表达产物约占全菌蛋白 2 0 % .该融合蛋白主要以可溶性形式存在 ,通过金属离子 (Ni2 +)螯合亲和层析予以纯化 ,纯度在 90 %以上 .体外标记结果表明 ,融合表达的P17mHT能被人NMT有效地N端豆蔻酰化 .这些结果为深入研究筛选HIV 1GagP17或P55的豆蔻酰化专一性抑制剂 。

构建融合蛋白提高重组葡萄糖异构酶的催化性能

为研究Ⅱ型Xylose/Glucose的N端蛋白序列对I型Xylose/Glucose的作用,实验将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶(TTGIase)N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的Ⅰ型葡萄糖异构酶(TFGIase)的N端,构建了融合蛋白N-TFGIase。实验结果显示:在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase,菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%,比酶活比TFGIase高出26%,最适温度比TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适pH较TFGIase降低1.0。序列分析表明:TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST-C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。