Luman-N-端融合蛋白的表达、纯化及小鼠免疫效果评价

Luman-N-端基因转化菌BL21在IPTG的诱导下,用SDS-PAGE检测表达情况,经电洗脱法纯化,利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和淋巴细胞增殖转化试验评价免疫效果。结果显示:细菌经IPTG诱导后在56 kD处,出现了特异性蛋白条带,与预计融合蛋白大小一致,融合蛋白经电洗脱纯化后免疫小鼠,间接ELISA显示抗体效价达到1∶4000,淋巴细胞增殖试验表明与空白组相比,Luman-N-端融合蛋白质量浓度为10、20、40和60μg/mL时,能显著刺激淋巴细胞的增殖(P<0.05);质量浓度为80、100μg/mL能极显著地刺激淋巴细胞的增殖(P<0.01)。

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果 经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的

甲状旁腺激素和转铁蛋白N端半分子融合蛋白在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术将PTH(parathyroidhormone,甲状旁腺激素)基因与TFN(transferrinN_terminalhalf_molecule,转铁蛋白N端半分子)基因在体外融合,融合基因克隆至真核表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母GS115。转化子经甲醇诱导后,融合蛋白得到了表达并分泌到发酵上清液中。经SPSepharoseFF阳离子交换层析、PhenylSepharoseFastFlow疏水层析纯化获得了纯度大于95%的PTH_TFN样品。Westernblot分析及腺苷酸环化酶实验证明融合蛋白中的PTH具有与抗PTH抗体结合能力及刺激腺苷酸环化酶的活性,铁饱和实验证明融合蛋白中的TFN和单独的TFN具有相同铁结合能力。因而TFN可望作为PTH的天然运输载体。

心肌营养素1／破伤风毒素重链C端片段融合蛋白的构建及其靶向大鼠嗜铬细胞瘤细胞的研究

目的:探讨心肌营养素1(cardiotrophin 1,CT1)/破伤风毒素重链C端片段(tentanus toxin Cfragment,TTC)(CT1/TTC)融合蛋白的构建及其对大鼠嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,PC12)细胞的靶向性。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)、T-A克隆等分子生物学方法构建CT1/TTC融合蛋白。体外培养PC12细胞,并将CT1/TTC融合蛋白与PC12细胞共培养,红色荧光免疫组化染色后在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白能否在TTC的靶向作用下进入PC12细胞。结果:成功构建了CT1/TTC融合蛋白,测序显示融合基因序列正确,免疫组化染色结果显示融合蛋白能够进入PC12细胞,并发出红色荧光。结论:采用PCR和T-A克隆等分子生物学方法能成功构建CT1/TTC融合蛋白,并且TTC能够将CT1靶向进入PC12细胞。

端粒保护蛋白过表达对HeLa细胞染色体端-端融合和端粒酶活性的影响

目的观察人端粒保护蛋白1(human protection of telom eres 1,hPOT1)基因过表达对HeLa细胞染色体端-端融合和端粒酶活性的影响。方法利用先前构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞介导hPOT1基因过表达;秋水仙碱阻滞细胞周期于分裂中期,DAPI荧光染色分析染色体端-端融合;Telom erase PCR-ELISA试剂盒检测端粒酶活性。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞5 d后,染色体端-端融合几率增加,对端粒酶活性无明显影响。结论提示hPOT1蛋白可导致染色体端-端融合。

Luman-N端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。

结核分枝杆菌ESAT-6抗原和HSP70截短后C端片段融合蛋白的克隆、表达及免疫原性研究

结核病（TB）仍是一个主要的威胁世界公共健康的问题。选定结核分枝杆菌（MTB）的免疫原，以期能有效诱导保护性免疫应答是开发研究TB疫苗的最终目的。本研究设计制造了一种新结核分枝杆菌融合蛋白，包括作为有效免疫原的MTBESAT-6（早期分泌靶抗原相对分子质量6000），融合至MTBHSP70的c端（HSP70359-610），HSP70则为合适的载体和佐剂。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300)。方法采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300,T-A克隆后依次构建至表达载体pET-28a(+),转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),测序鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC O157∶H7基因组中分别扩增出了约580bp(espA)和900bp(eaeC300)的目的片段,将二者融合构建了重组质粒pET-28a(+)-espA-eaeC300,测序结果与理论预测值一致性为99.9%(1501/1502)。融合蛋白在工程菌中表达量约40%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量(Mr)约54×103Da,破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体洗涤后纯化,获得目的蛋白纯度约90%。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白(EspA-IntiminC300),此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,为研制EHECO157∶H7多亚单疫苗奠定了基础。

融合表达β趋化因子受体5NH_2端膜外第一襻及其特异抗体F(ab′)_2的制备

目的：研究β趋化因子受体５（ＣＣＲ５）ＮＨ２端膜外第一襻结构域的功能及其特异抗体Ｆ（ａｂ′）２的制备。方法：计算机分析趋化因子超基因家族，定位超基因家族中同源顺序最低的结构域ＮＨ２端膜外结构域，ＰＣＲ扩增出该结构域１１４个核苷酸序列。构建融合表达载体ｐＧＥＸ－ＩＮ／ＮＲ５，经测序鉴定正确后，在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达，经纯化后免疫新西兰兔。蛋白Ａ亲和层析和胰蛋白酶消化ＩｇＧ，经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－１２柱层析制备Ｆ（ａｂ′）２。结果：经还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＦＡＸ分析证明得到抗ＣＣＲ５ＮＨ２端的特异性抗体。结论：本方法为一简捷快速的特定功能结构域抗体Ｆ（ａｂ′）２制备方法，对研究该基因在体内的表达及生物学功能提供了重要的实验材料，同时也对超基因家族中亚家族特异抗体研制提供了一种研究思路和方法。

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional ge-nomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment searchtool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基)。该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构。与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。

Ssp dnaB蛋白质内含子介导的精氨酸激酶N末端结构域的表达

采用聚合酶链式反应(PCR)扩增精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)N端基因片段,经双酶切后连接至含有蛋白质内含子Ssp DnaB基因的质粒载体pTWIN1中,将Ssp dnaB和N-domain的融合基因利用双酶切手段重组到含有组氨酸标签(His-tag)的质粒载体pET-28a中,得到含有组氨酸标签的融合蛋白基因,并在大肠杆菌Rosetta中表达,为获得具有天然氨基酸序列的精氨酸激酶N端结构域打下基础。

中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性

将Omp L17基因克隆于p GEX- 1λT载体,在大肠杆菌JM10 9中表达分子量约为5 4 KDa的GST-Omp L17融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约2 8KDa的Omp L17蛋白。用纯化的Omp L17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1∶4 896 )。本研究获得了纯化的Omp L17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础。

出血性大肠杆菌O157 eae-stx1/2B融合基因的构建和表达

构建表达eae和stx1/2B的融合基因,克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分,以正确地阅读框定向插入到含有stx1/2B融合基因的质粒,构建重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50.67%。由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成,可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体,在E-HECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

重组钩端螺旋体多抗原位点同源合成基因的表达及其抗原性鉴定

目的:构建重组钩端螺旋体(钩体)优势抗原表位原核表达系统,以期获得高纯度的钩体优势抗原表位重组融合蛋白,为进一步研究钩体快速检测方法奠定基础。方法:利用基因重组的方法构建表达质粒pET-rLP。经IPTG诱导后,获得高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,包涵体蛋白经尿素变性溶解,采用镍离子亲和纯化,利用SDS-PAGE、Western blotting和间接ELISA法鉴定。结果:在相对分子质量为20 000处有1条特异性蛋白条带,为重组钩体优势抗原表位融合蛋白;ELISA结果显示其可与钩体阳性血清特异性结合,而与其他血清无交叉反应。结论:成功构建重组钩体优势抗原表位原核表达系统,并获得高纯度的重组钩体优势抗原表位融合蛋白。

Ⅱ型葡萄糖异构酶N端随机卷曲序列的嫁接效应

木糖/葡萄糖异构酶(xylose/glucose isomerase,XIase/GIase)是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶(TTGIase)N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的I型葡萄糖异构酶(TFGIase)的N端,构建了融合蛋白NTFGIase。发酵实验结果显示,在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%;酶学检测结果显示,N-TFGIase比酶活较TFGIase高出26%,最适温度较TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适p H较TFGIase降低1.0。序列分析表明,TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。实验结果提示,将来自超嗜热菌的Ⅱ型XIase/GIase的N端随机卷曲序列融合到I型XIase/GIase N端,能够提高后者的热稳定性、酸稳定性和表达效率等酶学性质,与我们的预测结果相一致,这为酶的分子改造和生产应用提供了参考。

人乳铁蛋白肽的分子改良及在大肠杆菌中的表达研究

采用SOE-PCR技术,设计合成hLF18-40的编码基因;以融合表达策略构建了pET-43.1a-hLF18-40表达质粒,并获得较高的可溶融合蛋白表达;将融合蛋白Nus-hLF18-40进行Ni2+柱亲和层析、除盐、浓缩后,用肠激酶切割释放抗菌肽hLF18-40,为今后基因工程法表达人乳铁蛋白肽提供了依据。同时,将hLF18-40的C末端氨基酸逐一缩短直至hLF18-32,用化学法合成hLF18-40、hLF18-39、hLF18-38、hLF18-37、hLF18-36、hLF18-35、hLF18-34、hLF18-33和hLF18-32等9条肽,采用肉汤微量稀释法分别测定其最小抑菌浓度(MIC),结果发现:hLF18-40的MIC为40μmol.L-1,hLF18-39的MIC略微下降(20～40μmol.L-1),hLF18-35的MIC与hLF18-40的相同。

HIV-1 Gag P17m的融合表达、纯化及NMT有效底物

利用PCR技术扩增编码HIV 1GagP17m的DNA片段 ,进而构建了T7启动子控制下的C端His Tag融合表达质粒pMF P17mHT .SDS PAGE分析结果表明 ,融合蛋白 (约 2 1kD)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中得到高表达 ,表达产物约占全菌蛋白 2 0 % .该融合蛋白主要以可溶性形式存在 ,通过金属离子 (Ni2 +)螯合亲和层析予以纯化 ,纯度在 90 %以上 .体外标记结果表明 ,融合表达的P17mHT能被人NMT有效地N端豆蔻酰化 .这些结果为深入研究筛选HIV 1GagP17或P55的豆蔻酰化专一性抑制剂 。

MYH7基因突变致Laing远端肌病伴脊柱侧凸1例报道

Laing远端肌病(OMIM:160500)是一种由编码骨骼肌和心室1型纤维的肌球蛋白重链7(recombinant myosin heavy chain 7,MYH7)基因(OMIM:160760)突变引起的罕见遗传性远端肌无力病[1]。该疾病在国内少有报道,我们收治了1例通过基因诊断确诊为MYH7基因突变所致的Laing远端肌病伴有脊柱侧凸的患者,择期行后入路胸腰椎融合及后入路腰骶融合术对脊柱进行矫形,总结分析其临床资料并对相关文献资料进行复习,以期提高对本疾病的认识,报道如下。

以重组融合蛋白为基础的钩端螺旋体酶联免疫吸附试验检测试剂盒的初步研制

目的建立以钩端螺旋体融合蛋白LipL32-LipL41(LipL32:脂蛋白L32,lipoprotein32;LipL41:脂蛋白L41,lipoprotein41)为包被抗原的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂。方法选择问号钩端螺旋体LipL32和LipL41作为研究靶标,采用连接引物PCR法构建lipL32-lipL41融合基因,原核表达获得重组蛋白,以该蛋白为包被抗原建立ELISA检测体系,对检测体系的灵敏度、特异性、稳定性等性能指标进行评价。结果扩增获得了1 900 bp左右的lipL32-lipL41融合基因,原核表达出了90 kDa左右的重组融合蛋白LipL32-LipL41,建立了基于LipL32- LipL41的ELISA检测体系,采用77例确诊病例和85例阴性对照血清进行初步验证,检测体系的灵敏度为96.1%,特异度为97.6%,粗一致性为96.9%,约登指数为0.937。结论以LipL32-LipL41重组融合蛋白为包被抗原建立ELISA免疫检测初步验证的灵敏度、特异性和稳定性较好,可进行下一步验证工作。