粪便蛋白Luminex液相芯片检测系统构建及其对结直肠肿瘤早期诊断的价值

目的基于Luminex液相芯片检测系统构建粪便人源性蛋白诊断体系,并评估其对结直肠肿瘤的早期诊断价值。方法收集2021年1月~2023年1月蚌埠医学院第一附属医院收治的结直肠癌(CRC)患者70例为CRC组、结直肠腺瘤(CRA)患者42例为CRA组,以及同期健康对照(HC)受试者38例为HC组。收集各组受试者粪便,使用Tris-Hcl缓冲液提取粪便总蛋白,通过Luminex液相芯片检测技术分析3组受试者粪便中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、人源性视黄醇结合蛋白4(RBP4)、甲壳素酶-3样蛋白1(CHI3L1)和补体成分3a(C3a)的水平差异;收集受试者外周血,分离血清检测癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)的水平;使用受试者工作曲线(ROC)分析MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a联合以及CEA和CA19-9联合对CRC、CRA、CRC和CRA的诊断效能,并比较两种组合诊断效能的差异。结果CRC组患者粪便中MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a水平均显著高于HC组(P<0.05),CRC组粪便中MMP-9和CHI3L1水平显著高于CRA组(P<0.05),但是RBP4和C3a在CRC和CRA组间并无显著性差异(P>0.05);另外,CRC患者外周血中CEA和CA19-9水平均显著高于HC组和CRA组(P<0.05),但是CRA组和HC组之间无显著性差异(P>0.05)。ROC曲线分析显示,MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a联合诊断CRC的灵敏度为91.4%,特异度为100.0%,联合诊断CRA的灵敏度为81.0%,特异度为89.5%,联合诊断CRC和CRA的灵敏度为83.9%,特异度为97.4%。Z检验比较分析显示,粪便蛋白MMP-9、RBP4、CHI3L1和C3a联合诊断CRC,CRA以及CRA和CRC的效能显著优于外周血肿瘤标志物CEA和CA19-9(P<0.05)。结论Luminex液相芯片检测粪便人源性蛋白RBP4、MMP-9、CHI3L1、C3a对结直肠肿瘤早期诊断具有价值且优于外周血肿瘤标志物CEA和CA19-9,具有较高的临床应用推广意义。

食源性沙门氏菌携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因的液相芯片检测技术研究

目的:建立应用新型液相芯片技术检测食源性沙门氏菌携带的质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因中4种基因:qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB的方法。方法:针对食源性沙门氏菌携带的qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB四种PMQR基因,设计对应引物和微球,采用液相芯片技术对7株标准菌株进行特异性实验;对4株各含1种PMQR基因的食源性沙门氏菌进行重复性和灵敏度实验;然后检测来自食源性风险监测的71株耐喹诺酮类沙门氏菌,和普通PCR进行对比实验。结果:成功建立了液相芯片技术检测食源性沙门氏菌携带的qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB四种PMQR基因的方法,携带qnrS基因的耐药株检出限为5 CFU/mL、携带aac(6')-Ib-cr基因的耐药株检出限为25 CFU/mL、携带oqxA和oqxB基因的耐药株检出限为10 CFU/mL。所有阳性判定结果荧光中位值(MFI)均≥5倍阴性对照组。重复性实验变异系数(CV)均小于5%,特异性实验结果特异性100%,阴性菌株无阳性信号反应。qnrS检出率29.6%(21/71)、aac(6')-Ib-cr 35.2%(25/71)、oqxA 28.2%(20/71)、oqxB 23.9%(17/71),方法比对的结果符合率为100%。结论:实验建立的液相芯片技术检测食源性沙门氏菌质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrS、aac(6')-Ib-cr、oqxA、oqxB的方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性强、结果准确的特点,可以为食源性沙门氏菌PMQR基因的检测以及耐药性的监控提供技术支撑。

基于Luminex液相芯片技术的NNK和AαC体外免疫毒性研究

目的了解4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)和2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AαC)的体外免疫毒性特征。方法分别以0、12.5、25、50、100、150和200μg/ml NNK染毒小鼠淋巴瘤细胞(EL-4细胞)24 h,以0、2.5、5、7.5、10、12.5和15μg/ml AαC染毒小鼠巨噬细胞(Ana-1细胞)24 h。采用CCK-8法检测细胞存活率,以Luminex液相芯片技术检测细胞上清液中与免疫相关的20种细胞因子分泌量,以BCA蛋白检测方法校正细胞因子的结果。结果 NNK染毒EL-4细胞后,白介素(IL)-10、IL-17、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量随染毒剂量的增加而升高,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量随染毒剂量的增加而降低,且均存在剂量-效应关系;碱性成纤维细胞生长因子(FGF-basic)、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、角质细胞诱导因子(KC)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、γ-干扰素诱导性单核因子趋化因子(MIG)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)含量无明显变化。AαC染毒Ana-1细胞后,IL-5、MCP-1、MIP-1α、TNF-α和VEGF含量随染毒剂量的增加而降低,其余15种细胞因子无明显变化。结论 NNK和AαC可以产生体外免疫毒性。

液相芯片技术在动物遗传育种中的应用

液相芯片技术是近年来发展起来的一种先进的高通量分子检测技术,集一体化流式细胞术、荧光微球和激光技术等技术优势,具有快速、简便、敏感、准确和成本低等优点。相比其他检测技术,液相芯片可以同时检测多个生物分子指标,如蛋白质、核酸和代谢产物等。在动物遗传育种中,这些分子指标可以用于疾病基因定位、群体繁殖力评价、亲缘关系研究、遗传多样性分析等重要领域。该文介绍了液相芯片的原理、优缺点及其在动物遗传育种中的应用,以期为辅助开发动物遗传育种检测新技术提供参考。

Luminex液相芯片的发展及应用

液相芯片技术是20世纪90年代兴起的,集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术。它的最大特点是通量大、灵活性好。Luminex公司利用液相芯片技术先后推出了Luminex 100、Luminex 200和Flexmap 3D液相芯片检测平台。现对Luminex液相芯片的发展、原理及应用作一简介。

用液相芯片技术定量测定人血清CEA、AFP和HBsAg

【目的】采用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg),并对该方法进行评价。【方法】制备抗体交联微球及生物素标记抗体,用双抗体夹心法对临床血清标本进行测定。【结果】同时检测CEA、AFP和HBsAg时的线性范围分别为0.032～200ng/mL、0.022～55U/mL、0.26～1000ng/mL,最低检测限分别为8.90pg/mL、0.013U/mL、0.24ng/mL,批内变异系数(CV)<9%,批间CV<14%。检测CEA、AFP、HBsAg的灵敏度分别为96.4%、95.8%、92%,特异度分别为95.6%、94.2%、100%,准确度分别为96%、95%、96%。其检测结果与化学发光免疫分析法(CLIA)或时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)之间呈显著的等级相关关系。该方法仅需1!L标本,3h即可完成检测。【结论】液相芯片技术具有可联合检测多项指标、高通量、线性范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有临床应用潜力。

液相芯片技术检测乙型肝炎病毒表面抗原

目的建立乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)液相芯片检测法并进行评估。方法将4种不同来源的HBsAg单克隆抗体分别包被在不同的羧基化微球上,利用双抗体夹心法原理建立液相芯片检测HBsAg的方法。检测定值血清、标准血清盘以及本中心献血者筛选保留的随机43份HBsAg阳性标本和500份HBsAg阴性标本,并评估方法的敏感性和特异性。结果液相芯片法检测HBsAg灵敏度可达到0.2IU/ml。在标准血清盘中,HBsAg阳性符合率为25/25,阴性符合率为14/15。在收集的43份阳性标本、500份阴性标本中,HBsAg阳性标本符合率为100%,阴性标本符合率分别为99.4%。4种不同来源HBsAg单克隆抗体的检测结果存在差异,可以互补。结论建立的液相芯片方法可有效检测HBsAg。

Luminex液相芯片同时检测tPSA和fPSA方法的建立与评价

目的建立用Luminex液相芯片技术同时测定前列腺特异性抗原（total prostate specific antigen,tPSA）和游离前列腺特异性抗原（free prostate specific antigen,fPSA）的方法,并对该方法进行评价。方法制备抗体交联微球及藻红蛋白标记二抗,用双抗体夹心法对临床血清标本进行测定,并与ELISA方法进行比较。结果Luminex液相芯片技术同时测定tPSA、fPSA与ELISA测定结果高度相关。Luninex方法测定tPSA的灵敏度为0.03 ng/L,批内精密度为4.38%~5.86%,批间精密度为3.40%~6.73%;测定fPSA的灵敏度为0.013 ng/L,批内精密度为5.08%~7.94%,批间精密度为3.77%~5.74%。结论Luminex方法同时测定tPSA、fPSA具有灵敏度高、重复性好、系统误差小等优点,具有广泛的临床应用前景。

液相芯片技术的原理与应用进展

液相芯片是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的新型芯片技术,具有高通量、灵活、快速、准确、重复性好、操作简便等众多优点,可用作蛋白质和核酸等生物分子的高通量检测平台。本文简要介绍其原理、优点,并对该技术在基础研究、临床诊断等方面的应用进展作一综述。

液相芯片技术在诊断江苏省首例人禽流感病例中的应用

[目的]对2007年12月江苏省发生的一例不明原因肺炎病例进行液相芯片检测,探讨该技术在不明原因肺炎诊断中的作用。[方法]采集病例的呼吸道标本,利用液相芯片方法对呼吸道重要致病体进行核酸检测。[结果]呼吸道标本甲型流感病毒,H5及N1亚型禽流感病毒特异性核酸均为阳性。[结论]应用液相芯片技术,可快速确定该不明原因肺炎病例为高致病性禽流感(H5N1)感染,为及时防控和治疗提供依据。

液相芯片技术在核酸检测中的应用研究进展

随着人类基因组计划（HGP）的完成和数量巨大的遗传信息的获得．人们的兴趣转向了解个体之间基因的差异性以及这种差异如何影响不同个体对疾病的敏感性及对药物的反应性。在公共卫生领域，也需要对引起突发公共卫生事件如不明原因的传染病的病原进行快速筛查，这都需要对DNA样品进行快速、可靠、经济和高通量的检测。美国纳斯达克上市的Luminex公司研发的液相芯片技术（又称微球依赖的悬浮点阵技术．

液相芯片技术检测癫痫大鼠海马组织RANTES、MCP-1、IP-10的表达研究

目的：观察趋化因子RANTES、MCP-1、IP-10在癫痫大鼠海马组织中的表达情况,探讨百会穴治疗癫痫的作用机制。方法：将30只200~250 g的雄性SD大鼠随机分为正常空白组、正常百会组、模型空白组、模型百会组。建立氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠模型,针刺其百会穴。运用液相芯片技术检测癫痫大鼠海马组织中RANTES、MCP-1、IP-10的蛋白表达情况。结果：四组大鼠RANTES、MCP-1、IP-10的表达情况均为：模型空白组的蛋白表达量明显高于正常空白组（P〈0.05）;模型百会组高于正常百会组（P〈0.05）;模型百会组低于模型空白组（P〉0.05）;正常空白组和正常百会组相比（P〉0.05）。结论：大鼠海马组织趋化因子RANTES、MCP-1、IP-10参与了癫痫疾病的发生和发展过程;针刺百会穴未能通过降低RANTES、MCP-1、IP-10的蛋白含量来达到治疗癫痫的目的。

液相芯片技术同时检测六种猪繁殖障碍病毒的方法研究

在GenBank中收集猪细小病毒（PPV）结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型（PCV2）的ORF2序列、猪伪狂犬病毒（PRV）的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的NSP2基因、猪瘟病毒（CSFV）的E2基因和乙型脑炎病毒（JEV）的M基因，利用Primer 5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较，筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针，将设计好的探针与相应的微球偶联，优化条件，建立检测方法。结果表明：建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV 6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性，对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV 6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×102 copies/μL、2.87×102 copies/μL、2.07×102 copies/μL、2.61×102 copies/μL、2.34×102 copies/μL、2.05×102 copies/μL，与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比，敏感性提高了100-1000倍；对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测，结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。

Luminex液态芯片技术在克罗恩病诊断与病情监测中的应用

目的探讨Luminex液态芯片技术检测血清中细胞因子的表达在克罗恩病患者中的临床意义。方法选取不同严重程度克罗恩病(CD)患者76例作为研究对象,选取同期健康人群50例作为对照组。按照MILLIPLEX MAP Kit试剂盒的要求,利用Luminex技术检测血清中细胞因子白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)以及白细胞介素17A(IL-17A)的表达水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中抗酿酒酵母抗体(ASCA),分析CD组与健康对照组之间的差异。结果细胞因子表达水平除IL-17A外,CD组IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10水平均高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);活动期CD患者血清IFN-γ、TNF-α、IL-6水平明显高于缓解期和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中、重度活动期CD患者血清TNF-α、IL-6水平高于轻度活动期CD患者,差异有统计学意义(P<0.05);血清ASCA水平在CD组与健康对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),ASCA阳性患者TNF-α、IL-6水平显著高于ASCA阴性患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TNF-α、IL-6在CD患者的炎症发生和病情发展中起着重要作用,测定血清TNF-α、IL-6的水平可反映克罗恩病的病情程度。细胞因子水平动态变化与CD病情进展相关,对CD疾病检测和病情监测具有重要意义。

液相基因芯片技术在崇明地区人乳头瘤病毒检测和分型中的应用

目的探究液相基因芯片技术在崇明地区人乳头瘤病毒（HPV）检测和分型中的应用。方法选取2011年5月至2013年4月该院妇科门诊就诊者宫颈脱落细胞500例,使用液相基因芯片技术对其进行HPV基因型检测。并对80例患者进行病理诊断,根据组织病理学将80例患者分为炎性反应组、细胞学正常组、宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ组、CINⅡ组、CINⅠ～Ⅱ组、CINⅢ组。将病理诊断结果和HPV DNA亚型分布结果结合分析,对崇明地区宫颈病变程度和HPV感染基因型的关系进行分析。结果 500例标本中共180例HPV阳性患者,HPV总感染率为36%,共检出22种基因型,按照感染率从高到低依次为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染为85.96%,低危型感染为14.04%。500例标本中共180例HPV阳性患者,其中44例（24.44%）患者年龄为21～25岁的女性,11例（6.15%）患者年龄为51～67岁的女性,随着年龄的增大HPV阳性例数减少。随着宫颈病变级别的升高HPV感染率逐渐升高,两两比较结果显示,炎性反应组与正常组、CINⅢ组与CINⅡ组、宫颈癌组与CINⅡ组、宫颈癌组与CINⅢ组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;其余11对两两对比差异具有统计学意义（P〈0.05）。随着宫颈病变级别的升高HPV多重感染率逐渐升高,但是仅炎性反应组与CINⅢ、CINⅡ组间差异有统计学意义（P〈0.05）。将组织病理学作为确诊标准,液相芯片HPV DNA检测CINⅢ、CINⅡ的特异度为76.63%,灵敏度为88.57%,阴性预测值为92.16%,阳性预测值为68.89%。结论崇明地区常见的HPV感染基因型为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV阳性多发于年轻女性,且HPV多重感染和感染率均随着宫颈病变的程度加重而加重。因而液相芯片HPV DNA检查对大规模筛查和宫颈病变的临床诊断有十分重要的价值。

转基因小鼠常见传染病血清学液相芯片技术多重检测方法的建立

目的制备小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片,建立转基因小鼠传染病抗体的xMAP多重检测方法。方法将荧光微球分别与小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白进行偶联,并且对最佳蛋白偶联量、检测抗体最佳工作浓度和Streptavidin-PE最佳工作浓度进行优化,制备小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片,对56个转基因小鼠血清样品、阴性血清、阳性血清和质控血清进行xMAP多重检测。并应用传统的ELISA方法对xMAP检测结果进行验证。结果 1)小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶联量分别为20μg、20μg、40μg和20μg,检测抗体最佳浓度分别为2μg/mL、2μg/mL、2μg/mL和4μg/mL;Streptavidin-PE抗体最佳浓度均为2μg/mL;(2)xMAP检测结果显示,14号、23号、55号和56号转基因小鼠血清MHV MFI值和index值均高于质控血清,其余小鼠血清的MFI值和index值均低于质控血清,表明14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV抗体阳性,其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗体阴性;(3)ELISA检测结果显示,14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV A450值和index值均高于质控血清,其余小鼠血清的A450值和index值均低于质控血清,表明14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV抗体阳性,其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗体阴性,该ELISA检测结果与xMAP检测结果相一致。结论建立的xMAP多重检测技术可应用于转基因小鼠的传染病检测。

液相芯片技术检测宫颈HPV感染及基因型分布

目的探讨液相芯片(Luminex)技术检测宫颈人乳头瘤病毒(HPV)基因型的应用价值。方法用液相芯片技术对1 450例妇女进行宫颈脱落细胞HPV DNA基因分型检测,并对HPV感染率、亚型分布进行统计分析。结果 1 450例妇女中共检出404例HPV DNA阳性,总检出率为27.9%;共检出25种亚型(HPV 73型未检出),其中高危亚型感染占83.4%(337/404),低危亚型感染占10.6%(43/404),高危亚型、低危亚型混合感染占5.9%(24/404);HPV 16、58、52型是最常见的高危亚型,感染率分别为5.7%(83/1 450)、4.7%(68/1 450)、4.6%(66/1 450),HPV 61和6型是最常见的低危亚型,感染率分别为1.6%(23/1 450)和1.2%(17/1 450);≤24岁组妇女宫颈HPV感染率(46.0%)及HPV多重亚型感染率(47.8%)均为最高,各年龄组间HPV感染率差异显著(P均<0.01)。结论液相芯片技术可用于检测宫颈HPV感染及基因型分布。

液相芯片技术一步反应法联合定量测定人血清CEA、AFP和tPSA

目的建立用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和总前列腺特异性抗原(tPSA)水平的一步反应法,并对该方法进行评价。方法制备抗体交联微球及生物素标记抗体,用双抗体夹心法测定临床血清标本。结果联合测定CEA、AFP和tPSA的线性范围分别为0.063～200 ng/ml、0.052～66.6 ng/ml、0.016～20 ng/ml;最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml;批内精密度<10%,批间精密度<14%;血清标本CEA、AFP和tPSA检测值与化学发光免疫分析法(CLIA)测值的相关系数为0.920～0.940,与液相芯片两步反应法测值的相关系数为0.952～0.979。该方法仅需1μl标本,2 h即可完成检测。结论液相芯片一步反应法具有高通量、检测范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有较大临床应用潜力。

液相芯片技术在医学检验诊断中的应用

液相芯片技术可以从少量样本中快速得到大量的辅助诊断信息,正逐步从科学研究实验室进入临床实验室,在多种肿瘤标志物联合检测、自身抗体筛查、人类白细胞抗原分型及感染性病原体基因检测等方面具有重要的临床应用价值。现就液相芯片技术在医学检验中的应用做一综述。