Effects of chimeric intron on the epithelial-mesenchymal transformation of non-small cell lung cancer PC-9

Objective:To investigate the effects of Intron on the EMT capability of non-small cell lung cancer cell line PC-9.Methods:Firstly,using the psiCHECK-2 plasmid as a basic framework to construct the recombinant plasmid of psiCHECK-2-Intron dual-luciferase reporter gene;secondly,the psiCHECK-2-Intron and psiCHECK-2 were transfected into PC-9 cells respectively.The migration and invasion abilities of PC-9 cells were analyzed by Matrigel assay.The expression changes of EMT related hallmarks,including N-cadherin,β-catenin and snail,were detected by qRT-PCR and Western Blotting.Results:Compared with the control group,the migration and invasion abilities of PC-9 cells in Intron group significantly decreased(p<0.001).The expression of N-cadherin,β-catenin and snail also down-regulated(p<0.001).Conclusion:The introns could inhibit the EMT of PC-9 cells.

IL-9抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长及其作用机制

目的探讨白细胞介素9(IL-9)对小鼠肺腺癌生长的影响及其可能的作用机制。方法将小鼠肺腺癌CMT167细胞接种于BALB/C小鼠皮下,构建小鼠肺腺癌皮下移植瘤模型,观察IL-9对小鼠肿瘤生长的影响。采用流式细胞术(FCM)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠肺腺癌CMT167细胞IL-9受体(IL-9R)的表达情况。不同浓度IL-9体外作用于CMT167细胞后,观察不同时间点其细胞活力和细胞凋亡的变化。采用FCM法分析小鼠肿瘤组织中骨髓来源免疫抑制性细胞(myeloid-derived immunosuppressive cells,MDSCs)、CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞百分比的变化情况。结果与模型对照组小鼠相比,IL-9能够明显抑制小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生长,并减轻移植瘤的重量(均P<0.01)。小鼠肺腺癌CMT167细胞中IL-9R呈阳性表达。不同浓度IL-9体外作用小鼠肺腺癌CMT167细胞后其细胞活力和凋亡均无明显变化(均P>0.05)。IL-9降低了小鼠肿瘤组织中MDSCs的数量(P<0.05),同时增加了肿瘤组织中CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的比例(P<0.01)。结论IL-9能够抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长,这可能与IL-9降低小鼠肿瘤组织中MDSCs的数量,增加CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞比例有关。

lncRNA NEAT1通过抑制DNA损伤促进肺腺癌PC-9细胞的增殖

目的:研究长链非编码RNA核富集转录体1(lncRNA NEAT1)对肺腺癌PC-9细胞增殖能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法:qPCR检测人肺腺癌PC-9细胞与人胚肺二倍体2BS细胞中lncRNA NEAT1的表达水平;设计并合成lncRNA NEAT1的小干扰RNA(siRNA)序列,采用脂质体法转染PC-9细胞,通过qPCR检测转染前后PC-9细胞NEAT1的表达水平。MTT法、流式细胞术分别检测lncRNA NEAT1敲低对PC-9细胞增殖及细胞周期的影响;WB检测转染前后DNA损伤相关蛋白,即共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)和双链DNA损伤标志物γ-H2AX的表达水平。结果:与2BS细胞相比,PC-9细胞中lncRNA NEAT1呈高表达(P<0.05)。成功建立NEAT1敲低的PC-9细胞,转染siRNA 12 h后siNEAT1-1及siNEAT1-2干扰组细胞增殖能力较空白对照组及空转染组明显下降(P<0.05);干扰组细胞周期被阻滞在G1期[(88.97±2.64)%(,88.15±1.48)%vs(84.5±1.72)%,P<0.05]和G2/M期[(8.35±2.02)%,(8.11±1.36)%vs(4.28±1.28)%,P<0.05];干扰组细胞中DNA损伤相关蛋白ATM和γ-H2AX表达水平显著升高(均P<0.05)。结论:lncRNA NETA1在肺腺癌PC-9细胞呈高表达,其可通过抑制DNA损伤导致细胞周期G1/M期转变促进肺腺癌细胞PC-9的增殖能力。

CXCR4/SDF-1轴调节人肺腺癌PC-9细胞对Bends细胞血脑屏障模型功能的影响

目的:通过建立体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型,探讨人肺腺癌PC-9细胞在CXCR4/SDF-1轴作用下对BBB紧密连接蛋白的影响。方法:利用永生化的小鼠脑微血管内皮细胞Bends进行单层培养,建立体外BBB模型;通过跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)测定及荧光素钠通透性实验判定体外BBB模型的功能状态以及观察PC-9细胞对体外BBB模型功能的影响。Western blotting检测PC-9细胞在CXCR4抑制剂AMD3100、SDF-1单独或联合(1μg/ml AMD3100,100 ng/ml SDF-1,AMD3100+SDF-1)作用下对BBB模型功能和内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响,Transwell迁移实验检测CXCR4/SDF-1轴对PC-9细胞跨BBB模型细胞层迁移能力的影响。结果:Bends细胞单层培养可形成紧密连接的"屏障"并产生较高的TEER,第96 h达到(182.13±5.19)Ω·cm^2;同时行荧光色钠通透性实验结果显示,BBB具有良好屏障性能,其通透率低于空白对照组(P<0.05)。PC-9细胞作用后,BBB模型TEER逐渐降低,第24 h降至(46.7±4.35)Ω·cm^2;同时BBB通透率较作用前显著提高(P<0.05)。PC-9细胞在AMD3100作用下能够上调内皮细胞紧密连接蛋白的表达(P<0.05);AMD3100处理组的PC-9细胞穿过BBB的细胞数较空白组明显减少[(43±2)vs(81±2)个,P<0.05]。结论:AMD3100能够减弱PC-9细胞对Bends细胞建立的体外BBB模型紧密连接的破坏能力。

沉默FGL1增强人肺腺癌PC-9细胞对多西他赛敏感性的研究

目的探讨沉默纤维蛋白原样蛋白1(fibrinogen-like protein 1,FGL1)对人肺腺癌PC-9细胞多西他赛敏感性的影响。方法Western blot法检测人正常支气管上皮细胞株BEAS-2B及人肺腺癌细胞株PC-9中的FGL1蛋白表达情况。以siRNA沉默PC-9细胞株中FGL1基因,CCK-8法检测沉默FGL1对PC-9细胞增殖的抑制作用及对多西他赛敏感性的影响。结果与BEAS-2B细胞株比较,FGL1在PC9细胞株中呈高表达,其蛋白相对表达量是BEAS-2B细胞株的6.5倍,差异具有显著性(P<0.01)。通过转染FGL1siRNA沉默FGL1可增强多西他赛对PC-9细胞增殖的抑制作用。与FGL1siNC组细胞相比,FGL1siRNA组PC-9细胞的IC50值明显降低,差异具有显著性(P<0.01)。结论特异性沉默FGL1基因可抑制人肺腺癌细胞PC-9中FGL1的表达,抑制PC-9细胞的增殖,提高对多西他赛的敏感性。

苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌PC-9细胞增殖和c-myc表达的影响

目的:研究贝特类药物苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌PC-9细胞增殖和c-myc表达的影响。方法:采用CCK8法检测苯扎贝特和非诺贝特(12.5、25、50、100、20μmol/L)作用48 h对PC-9细胞存活率的影响。另将PC-9细胞分为给药组和对照组,给药组分别加入低、中、高浓度(25、50、100μmol/L)的苯扎贝特和非诺贝特,对照组加入二甲基亚砜,作用48 h后,采用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况;荧光定量聚合酶链法(qRT-PCR)检测细胞中c-myc mRNA相对表达量;Western blot法检测细胞中c-myc蛋白相对表达量。结果:上述浓度苯扎贝特作用下PC-9细胞存活率分别为(80.76±3.2)%、(74.35±5.06)%、(62.8±1.23)%、(59.03±1.55)%、(39.8±1.01)%;而非诺贝特作用下PC-9细胞存活率分别为(74.46±1.30)%、(61.91±4.77)%、(48.95±2.8)%、(37.05±1.55)%、(32.49±1.36)%。与对照组比较,苯扎贝特和非诺贝特的中、高浓度组G1期细胞比率均明显增加,苯扎贝特和非诺贝特的低、中、高浓度组的细胞凋亡率均明显增加,c-myc mRNA和蛋白相对表达量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:苯扎贝特和非诺贝特可抑制PC-9细胞增殖,并下调c-myc表达。

IL-23促进人肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭

背景与目的前炎症因子白细胞介素23(interleukin 23,IL-23)是与慢性炎症和肿瘤微环境相关的一种重要的细胞因子,同时IL-23受体在结直肠癌、肺癌、口腔鳞癌等肿瘤细胞中有表达。本研究旨在探讨IL-23能否促进人肺腺癌细胞A549的迁移和侵袭并探讨其机制。方法用划痕试验和Transwell小室法测定IL-23对A549的迁移和侵袭的影响,用Real-time PCR和ELISA检测IL-23对基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的mRNA和蛋白表达的影响,通过IL-23中和抗体阻断IL-23的作用,进一步证实IL-23对A549迁移和侵袭的影响。结果 IL-23明显增加了A549细胞的迁移和侵袭能力;同时IL-23能提高A549细胞MMP-9的mRNA表达和其培养上清中MMP-9的蛋白表达,IL-23中和抗体能有效地阻断IL-23对A549的迁移和侵袭的作用。结论 IL-23可刺激A549细胞表达MMP-9,从而促进A549细胞的迁移和侵袭。

补中益气汤含药血清干预TGF-β介导的A549细胞MMP-9表达影响的研究

目的:利用补中益气汤含药血清干预TGF-β介导的肺腺癌A549细胞,观察A549细胞中MMP-9的表达变化,探讨补中益气汤在肺癌EMT中侵袭和转移过程中的作用。方法:体外培养A549细胞,用TGF-β进行干预,MTT法检测补中益气汤含药血清对A549细胞的抑制率,免疫细胞化学方法、Western blot和实时荧光定量PCR等方法检测MMP-9在蛋白及基因水平上的表达。结果:TGF-β干预后,MMP-9的表达量上调(P<0.05),与TGF-β诱导组相比,补中益气汤高、中、低剂量含药血清组可提高对A549细胞的抑制率(IR)(P<0.01),且能减少MMP-9在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.05)。结论:MMP-9能作为肺癌EMT过程中有无侵袭转移的良好预测指标,且补中益气汤能够有效降低MMP-9在蛋白及基因水平上的表达,进而抑制A549细胞的侵袭转移,从而逆转EMT。

基质金属蛋白酶-9反义寡核苷酸对人肺腺癌细胞凋亡及转移能力的影响

背景与目的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是一个重要的细胞外基质降解酶,与肿瘤的发生发展生长密切相关。本研究初步探讨MMP-9反义寡核苷酸(MMP-9ASODN)对人肺腺癌细胞A549凋亡及转移能力的影响。方法MTT法检测MMP-9ASODN转染对A549细胞生长的影响;流式细胞术检测MMP-9ASODN对A549细胞周期和凋亡比率的影响;MTT比色法和划痕迁移试验观察MMP-9ASODN对A549细胞体外黏附以及迁移的影响。结果MMP-9ASODN对A549细胞存活率抑制呈浓度和时间依赖性,MMP-9ASODN浓度为600nmol/L、作用48h时抑制作用最明显;与对照组相比,转染MMP-9ASODN的A549细胞凋亡百分比明显升高(P<0.01),而黏附力及迁移细胞数显著降低(P<0.01)。结论MMP-9ASODN在体外能够显著降低A549细胞的黏附及迁移能力,有效地抑制肺癌A549细胞的增殖,同时促进其凋亡。

上调THBS1蛋白的表达对肺腺癌H1975细胞迁移能力的影响

目的:探讨上调血小板凝血酶蛋白1(THBS1)的表达对肺腺癌H1975细胞体外迁移能力的影响。方法:H1975细胞分为3组,空白对照组不处理,空载体转染组及pc DNA-THBS1转染组分别用脂质体转染空载体pc DNA3. 1和pc DNA3. 1-THBS1真核表达载体,采用划痕实验检测细胞迁移能力,用qRT-PCR、Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA、蛋白的表达情况。结果:与空白对照组和空载体转染组相比,pc DNATHBS1转染组H1975细胞迁移能力增强,细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达升高(P <0. 05)。结论:上调THBS1蛋白可以增强肺腺癌H1975细胞体外迁移能力。

HuRsiRNA对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:探讨HuR siRNA对人肺腺癌A549株细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能机制。方法:HuR siRNA瞬时转染肺腺癌A549细胞24 h后,CCK-8实验、集落形成实验检测细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qPCR和Western blotting检测HuR及基质金属蛋白酶(MMP)-9基因mRNA和蛋白质表达。结果:HuR siRNA能够抑制人肺腺癌A549细胞的增殖、迁移及侵袭;HuR siRNA显著降低A549细胞HuR、MMP-9 mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论:下调HuR能抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭,其机制与下调MMP-9有关。

爱康方含药大鼠血清对人肺腺癌A549细胞内Bad、Caspase-9蛋白及mRNA的作用

目的 探讨爱康方含药血清对人肺腺癌A549细胞内B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bad)、Caspase-9蛋白(Caspase-9蛋白)及mRNA的表达作用。方法 40只大鼠,采用随机分组法分为空白对照组(NS)、环磷酰胺组(CTX)、爱康方组(AKF)和爱康方联合环磷酰胺组(AC),每组10只。以人肺腺癌A549细胞为研究对象,依据前期研究结果选定20%的含药血清为最佳干预浓度,用各组含药血清分别干预细胞48、72 h后收集细胞用于检测。通过蛋白质印迹法(Western blot)测定干预后目的细胞中Bad、Caspase-9蛋白表达,实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)法测定Bad、Caspase-9 mRNA的表达。比较各组不同方法检测的Bad mRNA、Caspase-9 mRNA表达水平及Bad、Caspase-9蛋白表达水平。结果 48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于空白对照组,爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于环磷酰胺组和爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05);48 h时,环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于本组48 h,差异具有统计学意义(P<0.05)。48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于空白对照组,爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于环磷酰胺组和爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05);48 h时,环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于本组48 h,差异具有统计学意义(P<0.05)。48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad蛋白表达水平明显高于空白对照组,环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组高于爱康方组,爱康方联合环磷酰胺组高于环磷酰胺组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad蛋白表达水平高于本组48 h,差异有统计学意义(P<0.05)。48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9蛋白表达水平明显高于空白对照组,环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组高于爱康方组,爱康方联合环磷酰胺组高于环磷酰胺组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9蛋白表达水平高于本组48 h,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 爱康方能抑制肺癌肿瘤生长,与环磷酰胺合用抑癌效果更佳,可能是通过上调A549细胞中促凋亡蛋白Bad、Caspase-9,诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。

用于活体成像的人肺腺癌自发骨转移小鼠模型

目的建立小鼠人肺腺癌PC-9细胞株骨转移模型,初步探讨由模型动物中分离上皮-间质细胞转化(EMT)癌细胞的可行性。方法采用肺原位注射法对低、中、高浓度组的雄性BALB/c裸鼠分别注射1×104、5×104、1×105个/20μL的高骨亲和性的人肺腺癌PC-9细胞悬液,对照组注射5×104/20μL的原始人肺腺癌PC-9细胞,空白组注射20μL空白混合胶体,观察小鼠的生存时间、体重变化及肺腺癌骨转移模型的成模率,并采用流式细胞技术对分离外周血EMT癌细胞进行鉴定。结果注射PC-9细胞后21 d,对照组和低、中、高浓度组小鼠均出现体重下降、摄食减少等,与空白组相比体重明显降低(P<0.05)。高浓度组小鼠注射PC细胞后20 d出现骨转移病灶,27 d出现死亡。低、中、高浓度组的肺腺癌骨转移模型成模率分别为0%(0/5)、25%(2/8)、60%(6/10)。造模成功的小鼠肺部和骨骼出现转移灶,病理检查可见肺腺癌细胞,其外周血可成功分离EMT癌细胞,其中EMT癌细胞阳性小鼠骨转移发生率较高。结论本研究成功构建了可用于活体成像的人肺腺癌骨转移小鼠模型,并可从其外周血中分离EMT癌细胞,为肿瘤生长转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供了重要工具。

蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素对肺腺癌A549细胞侵袭力的影响研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂星形孢菌素(STS)对肺腺癌A549细胞侵袭移动的影响及作用机制。方法:取A549细胞加入不同浓度STS(1、10、100 nmol.L-1)处理后,应用Transwell小室检测A549细胞移动抑制率和侵袭抑制率;免疫荧光染色法检测细胞内蛋白水解酶基质金属蛋白水解酶-9(MMP-9)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白表达;激光共聚焦法观测细胞内骨架蛋白微管蛋白α-tubulin的分布,Western blot法检测胞膜和胞浆内PKC-α活性。同时设立不加STS处理的对照组进行比较。结果:与对照组比较,A549细胞的移动抑制率、侵袭抑制率、MMP-9和uPA蛋白表达量均明显下降(P<0.05或P<0.01);胞浆内α-tubulin蛋白分布不均;胞膜内PKC-α蛋白含量减少,而胞浆内PKC-α蛋白含量无明显变化。结论:PKC抑制剂STS能抑制A549细胞移动和侵袭;其机制可能与抑制PKC-α的活性,减弱肿瘤细胞中MMP-9、uPA表达,诱导肿瘤细胞骨架变化相关。

羟氯喹对肺癌细胞恶性生物学行为影响

目的探讨羟氯喹对肺癌细胞恶性生物学行为及细胞外信号调节激酶(ERK)-血管内皮生长因子(VEGF)/基质金属蛋白酶-9(MMP-9)信号通路的影响。方法体外培养人肺腺癌A549细胞,取对数期人肺腺癌A549细胞分为低、中、高剂量实验组与对照组,分别以20,40,80μmol·L-1羟氯喹与等量生理盐水处理,各组均干预12,24,48 h。用Transwell实验及划痕实验分别检测人肺腺癌A549细胞侵袭与迁移能力;用噻唑蓝(MTT)法检测人肺腺癌A549细胞增殖;用蛋白质印迹(Wb)法检测人肺腺癌A549细胞ERK、VEGF及MMP-9蛋白的表达水平。结果干预48 h时,对照组与低、中、高剂量实验组人肺腺癌A549细胞侵袭率分别为(78.21±4.32)%,(50.22±3.14)%,(21.37±4.06)%,(8.95±3.73)%;划痕闭合率分别为(76.32±4.11)%,(64.52±3.96)%,(47.36±4.02)%,(21.64±5.21)%;ERK蛋白相对表达量分别为0.92±0.08,0.71±0.14,0.39±0.10,0.17±0.05;VEGF蛋白相对表达量分别为0.93±0.07,0.47±0.11,0.33±0.09,0.12±0.03;MMP-9蛋白相对表达量分别为0.91±0.09,0.68±0.12,0.41±0.13,0.09±0.02,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论羟氯喹可呈剂量依赖性地抑制人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与下调人肺腺癌A549细胞ERK、VEGF、MMP-9蛋白表达,抑制ERK-VEGF/MMP-9通路信号转导相关。