hnRNP B1 siRNA对肺癌组织hnRNP B1表达干扰效果的体内研究

目的在体内实验中观察所构建的核内不均一核糖核蛋白B1(hnRNP B1)特异性的siRNA真核细胞表达载体对肺癌组织hnRNP B1表达的干扰作用。方法选取转染本课题组已构建并经体外实验证实有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的siRNA真核细胞表达载体(重组质粒A和B)的人肺腺癌细胞株A549,将其接种于BALB/Cnu/nu裸鼠右前腋下,构建肺癌动物模型。分别应用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测接种40、60d时肿瘤组织中的hnRNP B1 mRNA和蛋白质表达水平。结果hnRNP B1特异性的siRNA真核细胞表达载体在体内表达40d时均能较稳定而明显地抑制肿瘤组织中hnRNP B1 mRNA的表达,免疫组织化学从蛋白表达方面也予以证实,而且重组质粒A和B两组间的表达的差异无统计学意义。但是随着时间的延长(接种60d时),siRNA的干扰效果会逐渐减弱,与未转染A549细胞比较无明显差异。结论hnRNP B1特异性的siRNA在体内可以稳定的表达,并且能特异、高效地抑制肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因的表达,有望成为肺癌基因治疗的合理策略之一。

肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因RNA干扰的体外研究

目的体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因表达及生长的抑制作用。方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响。结果针对hnRNP B1基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制。结论应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向。

纤维支气管镜刷检细胞核内不均一核糖核蛋白B_1染色诊断肺癌价值的研究

目的 探讨纤维支气管镜刷检细胞核内不均一核糖核蛋白B1(HnRNPB1)染色在肺癌诊断中的价值。方法 对 381例病理检查证实的肺癌患者及 10 0例非肺癌患者 ,经纤维支气管镜刷检脱落细胞涂片 ,采用抗HnRNPB1单克隆抗体免疫细胞化学染色 ,研究HnRNPB1诊断肺癌的敏感性与特异性 ,并与传统的CT及痰脱落细胞学检查进行比较。结果 381例肺癌患者均经纤维支气管镜检查于病变所在叶支气管进行刷检涂片 ,HE染色脱落细胞学检查发现癌细胞 2 18例 ,采用抗HnRNPB1单克隆抗体免疫细胞学检查 ,2 0 8例样本可见HnRNPB1染色。在癌细胞阴性的 16 3例样本中HnRNPB1染色阳性 12 1例 ,癌细胞阳性与阴性组间HnRNPB1表达有明显差异 (P <0 .0 5 )。不同病理类型肺癌的HnRNPB1表达为 :鳞癌 2 19例 ,HnRNPB1染色阳性 197例 (90 .0 % ) ;腺癌 10 8例 ,HnRNPB1染色阳性 85例 (78.7% ) ;小细胞癌 5 4例 ,HnRNPB1染色阳性 4 7例 (87.0 % )。鳞癌及小细胞肺癌HnRNPB1表达阳性率高于腺癌 (P <0 .0 5 )。HnRNPB1免疫细胞化学染色诊断肺癌的敏感性为 86 .4 % ,特异性为 91% ,假阴性率为 13.6 % ,假阳性率为 9% ,阴性提示率为 6 3.6 % ,阳性提示率为 97.3%。结论 HnRNPB1免疫细胞学检查诊断肺癌的敏感性明显优于痰脱落细胞学检查 。

hnRNPB_1基因的RNA干扰抑制肺癌细胞A549增殖研究

目的探讨特异性小分子干扰（small interference，siRNA）抑制肺癌A549细胞核内不均一核糖蛋白B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPB1）基因的表达后，对A549细胞增殖的影响。方法构建hnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549，观察重组载体分别在第1、4及6周对A549细胞hnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞周期及凋亡的影响。结果特异性siRNA真核表达可显著抑制肺癌细胞hnRNPB1基因的表达，使hnRNPB1 mRNA的表达减少46％～73％，蛋白表达减少77．69％～83．04％，作用时间至少可维持克隆形成后4周，同时，hnRNPB1基因表达下调抑制了A549细胞在体外的增殖，促进了肺癌细胞的凋亡。结论特异性siRNA能特异、高效地抑制肺癌细胞株A549细胞hnRNPB1基因的表达，RNAi可能为肺癌的基因治疗提供新策略。

LncRNA NEAT1调节miR-128-3p/HNRNPL轴对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及PD-1/PD-L1表达的影响

为探讨长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)核富集转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)免疫逃逸中的作用及机制,采集96例NSCLC患者的肿瘤及邻近正常组织,应用qRT-PCR检测NEAT1表达并分析其与NSCLC患者临床病理特征的相关性。以qRT-PCR检测人支气管上皮细胞16HBE和NSCLC细胞系中NEAT1、miR-128-3p、异质性胞核核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L,HNRNPL)和PD-L1 mRNA表达。将NEAT1干扰质粒(si-NEAT1)、miR-128-3p inhibitor及其对照(si-NC、inhibitor-NC)转染A549细胞,分为正常对照组、si-NC组、si-NEAT1组、si-NEAT1+anti-NC组和si-NEAT1+anti-miR-128-3p组,随后检测HNRNPL、PD-L1 mRNA和蛋白表达,以RNA沉降等法验证NEAT1、miR-128-3p和HNRNPL的调控机制。A549与CD8^(+)T细胞共培养,验证敲低NEAT1在NSCLC免疫逃逸中的作用,并以ELISA检测PD-L1和IFN-γ水平。结果显示,NEAT1在NSCLC组织中高表达,且与NSCLC肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。NSCLC细胞中,NEAT1、HNRNPL和PD-L1显著过表达,而miR-128-3p显著低表达(均P<0.05)。敲低NEAT1可上调miR-128-3p,抑制HNRNPL和PD-L1表达,降低NSCLC细胞活力并诱导其凋亡(均P<0.05),而NEAT1可靶向结合NSCLC细胞中的miR-128-3p。共培养发现敲低NEAT1的A549细胞可激活CD8^(+)T细胞,抑制其凋亡并降低PD-L1和IFN-γ水平(均P<0.05),而下调miR-128-3p可增加HNRNPL和PD-L1表达,减弱NEAT1敲低对NSCLC细胞增殖、凋亡及CD8^(+)T细胞活化的影响(均P<0.05)。由此,NEAT1可能通过miR-128-3p/HNRNPL轴促进PD-L1表达,从而导致NSCLC的免疫逃逸。