mTORC1/2双重抑制剂OSI-027抑制高氧诱导的肺成纤维细胞增殖和分化

目的分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)复合物1/2(mTOR complex 1/2,mTORC1/2)双重抑制剂OSI-027对高体积分数氧(高氧)所致人胚肺成纤维细胞增殖和分化的抑制作用。方法高氧(95%O_(2))处理人胚肺成纤维细胞MRC-5建立增殖分化模型,分为对照组、高氧组、高氧+OSI-027组和高氧+雷帕霉素组。Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原蛋白(collagen type I,Col I)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、RhoA、Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1,ROCK1)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)、p-AKT和mTOR的表达;CCK-8实验检测细胞活力;流式细胞术检测细胞周期。结果与对照组相比,PCNA、cyclin D1、Col I和α-SMA表达随高氧处理时间增加而增加(P<0.05)。与高氧组相比,OSI-027及雷帕霉素干预后,细胞活力下降,细胞周期被抑制在G1期(P<0.05)。高氧+OSI-027组PCNA、cyclin D1、Col I及α-SMA蛋白表达明显低于高氧组和高氧+雷帕霉素组(P<0.05)。高氧组mTOR信号通路蛋白RhoA、ROCK1、AKT、p-AKT和mTOR表达显著增高(P<0.05),但经OSI-027处理后均显著下降(P<0.05)。结论高氧可促进MRC-5细胞以时间依赖的方式增殖和分化,同时伴有mTOR信号通路活化。OSI-027可通过抑制mTOR通路抑制高氧处理后MRC-5细胞的增殖和分化,有望为临床干预高氧肺纤维化提供新的靶点。

大麻素受体2激动剂对人胚肺成纤维细胞株HLF1增殖和分化的影响及机制

目的探讨大麻素受体2(CB2)激动剂JWH133对人胚肺成纤维细胞株HLF1增殖、分化的影响及机制。方法取对数生长期HLF1细胞株,采用细胞计数试剂-8(CCK8)法检测不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00及20.00μmol/L)JWH133及CB2(0.0、0.5、5.0及50.0μmol/L)拮抗剂AM630对HLF1的增殖能力影响;取对数生长期HLF1细胞分为正常(N)组、5μg/L转化生长因子β1(TGF-β1)组(即0μmol/L JWH133)、10.00μmol/L JWH133(J10)组及J10+5.0μmol/L AM630(AM630)组,培养48 h,采用Western blot和逆转录-聚合酶链反应PCR(RT-qPCR)检测各组细胞中胶原蛋白1α1(Col1α1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化-AKT(p-AKT)蛋白及Col1α1、α-SMA mRNA,采用细胞免疫荧光检测各组细胞中α-SMA蛋白荧光信号及应力纤维细胞百分比。结果随着JWH133浓度的增大,HLF1细胞的吸光度(OD)值逐渐降低,0.0、0.5、5.0及50.0μmol/L AM630组HLF1存活率均在1附近(P>0.05);J10组HLF1细胞中Col1α1、α-SMA蛋白及p-AKT表达均较TGF-β1组降低(P<0.05),J10+AM630组则较J10组升高(P<0.05);J10组HLF1细胞Col1α1、α-SMA mRNA均较TGF-β1组降低(P<0.05),J10+AM630组则较J10组升高(P<0.05);J10组HLF1细胞α-SMA蛋白荧光信号及应力纤维细胞占总细胞比值均较TGF-β1组减少(P<0.05),J10+AM630组则较J10组增多(P<0.05)。结论CB2受体激动剂JWH133可抑制HLF1细胞的增殖及分化,其机制可能与下调PI3K-AKT通路有关。

丙烯腈对小鼠肺成纤维细胞增殖分化的影响

目的研究丙烯腈(ACN)对小鼠肺成纤维细胞增殖分化的影响。方法将ICR小鼠肺成纤维细胞纯化后进行细胞培养,加入二甲亚砜和浓度分别为0.01、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0μg/ml的ACN,作为对照组和染毒组,每组10个平行样。从细胞形态学角度,通过细胞计数,观察细胞生长与分化的过程,同时测定蛋白质含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果浓度为0.01、0.5、1.0、10.0μg/ml的ACN对小鼠肺成纤维细胞生长无抑制作用,而浓度达到50.0、100.0、200.0μg/ml时,小鼠肺成纤维细胞的增殖和分化明显受到抑制,集落形成率明显减少,细胞体积变小,且随着ACN浓度的加大,其抑制作用增大。当ACN剂量为50.0、100.0、200.0μg/ml时,小鼠肺成纤维细胞相对蛋白质含量低于对照组(P<0.05)。当ACN剂量为10.0、50.0、100.0、200.0μg/ml时,小鼠肺成纤维细胞MDA的含量高于对照组(P<0.01)。当ACN剂量为10.0、50.0、100.0、200.0μg/ml时,小鼠肺成纤维细胞SOD活力低于对照组(P<0.05)。结论ACN能抑制小鼠肺成纤维细胞增殖和分化,可能与其能抑制蛋白质合成,并引起脂质过氧化有关。

肝肺综合征患者血清对人肺成纤维细胞肌样分化、增殖与迁移的影响

目的 探讨肝肺综合征患者血清对人肺成纤维细胞肌样分化、增殖与迁移的影响.方法 人肺成纤维细胞接种于培养孔或培养瓶,采用随机数字表法分为2组（n=31）：肝肺综合征患者血清组和健康志愿者血清组,分别用含10％肝肺综合征患者血清的DMEM培养基或10％健康志愿者血清的DMEM培养基孵育.于孵育24、48和72 h（T1-T3）时,采用Western blot法检测人肺成纤维细胞平滑肌-α-肌动蛋白（SM-α-actin）和心肌肌凝蛋白（SM-MHC）的表达,采用3H-TDR法检测人肺成纤维细胞增殖能力,采用Transwell小室法检测人肺成纤维细胞迁移能力.结果 与健康志愿者血清组比较,肝肺综合征患者血清组各时点人肺成纤维细胞SM-α-actin和SM-MHC表达上调,T2,3时增殖和迁移能力增强（P＜0.05）;与T1时比较,肝肺综合征患者血清组T2,3时人肺成纤维细胞SM-α-actin和SM-MHC表达上调,增殖和迁移能力增强（P＜0.05）;与T2时比较,肝肺综合征患者血清组T3时人肺成纤维细胞SM-α-actin和SM-MHC表达上调,增殖和迁移能力增强（P＜0.05）.结论 肝肺综合征患者血清可促进人肺成纤维细胞肌样分化、增殖和迁移.

博来霉素和内毒素对鼠肺成纤维细胞增殖及表型转化的影响

目的探讨博来霉素(BLM)和内毒素(LPS)对肺成纤维细胞增殖及表型转化的影响及可能机制。方法分离、鉴定新生SD大鼠肺成纤维细胞,分为对照组、BLM组和LPS组。实验组加入不同浓度梯度的BLM(0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mg/L)和LPS(0.01、0.1、1、10、100 mg/L)。分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白含量。根据MTT结果进一步将BLM/LPS组分为低浓度组(分别为0.001、0.1 mg/L)和高浓度组(分别为1、10 mg/L),并且采用蛋白质印迹法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,透射电镜观察细胞超微结构,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤。结果HE染色显示原代培养的细胞呈成纤维细胞典型的纺锤形,免疫组织化学法鉴定示波形蛋白表达阳性。与对照组相比,在一定浓度范围内,BLM组和LPS组细胞增殖增高(P<0.05),且前者更显著;在较低浓度时,BLM组TGF-β1含量明显增高(P<0.05),随着浓度的增加,TGF-β1含量减少(P<0.05);而LPS各组TGF-β1含量比较差异无统计学意义。BLM/LPS低浓度组α-SMA蛋白表达增多(P<0.05);高浓度组α-SMA蛋白表达均明显减少(P<0.05),BLM组更显著。透射电镜显示,BLM低浓度组可见细胞核呈分叶状;BLM高浓度组细胞器明显水肿;LPS低浓度组和高浓度组均可见水肿的细胞器及分叶状细胞核。单细胞凝胶电泳结果显示,BLM与LPS低浓度组均可见明显彗星尾,二者彗星尾长差异无统计学意义;高浓度组彗星尾长进一步增加,且BLM组更明显。结论在一定浓度范围内,BLM和LPS均可促进肺成纤维细胞增殖及表型转化,且前者作用明显强于后者;BLM和LPS均可致不同程度的肺成纤维细胞DNA损伤,这可能与肺成纤维细胞不同程度增殖及表型转化有关。

小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞类器官三维培养体系的建立

本研究旨在建立小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(type 2 alveolar epithelial cells,AT2)类器官三维(three-dimensional,3D)培养体系的方法。采用酶消化与磁珠分选分离和纯化ICR小鼠肺AT2细胞,proSPC免疫荧光染色鉴定AT2细胞纯度;2维(two-dimensional,2D)培养8 d,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)掺入和荧光染色法观察AT2细胞的增殖与分化;将AT2细胞与小鼠肺成纤维细胞(mouse lung fibroblasts,Mlg)3D共培养,光学显微镜下观察类器官生长情况,收集生长13d的类器官,2%多聚甲醛固定后行HE染色,荧光染色观察类器官内部形态结构。结果显示,提取AT2细胞纯度超过95%;在体外培养1~8 d期间,AT2细胞EdU荧光染色阴性,未见增殖;AT2细胞形状逐渐趋向扁平鳞状、细胞表面积显著增大;在体外培养3 d后,有部分AT2细胞特异性标志物proSPC阳性细胞开始出现I型肺泡上皮细胞(type 1 alveolar epithelial cells,AT1)标志物T1α和HopX表达,培养5 d和8 d后T1α和HopX表达量进一步增加,proSPC的表达量和proSPC阳性细胞比例逐渐减小。AT2细胞与Mlg 3D共培养4 d时形成圆球样细胞团块,生长至13 d时形成肺泡类器官。组织学分析显示:肺泡类器官呈一空心小体;表达proSPC的AT2细胞主要分布于类器官的外侧;表达HopX、由AT2细胞转分化形成的AT1细胞则主要位于类器官小体的内部。proSPC/EdU双荧光染色显示:位于肺泡类器官外侧圈层的proSPC阳性AT2细胞中,有部分细胞表现为proSPC/EdU双阳性,表明类器官内的AT2细胞是具有增殖能力的细胞。以上结果显示,本研究成功建立了小鼠AT2类器官3D培养体系。

脂氧素A4对TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞增殖、分化的影响及机制

目的探讨脂氧素A4对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-1)增殖、分化的影响及其分子机制。方法将体外培养的HFL-1细胞分为3组,即对照组、TGF-β1组、TGF-β1+脂氧素A4组(联合组)。采用细胞计数试剂盒检测24、48、72 h时各组细胞增殖能力;实时荧光定量PCR和Western blot法分别观察各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原蛋白(COL-1)的mRNA和蛋白表达水平;Western blot法检测磷酸化核因子E2相关因子2(p-Nrf2)、总Nrf2及其下游抗醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表达水平。结果与对照组比较,TGF-β1组在24、48、72 h时细胞的增殖能力均明显增强(P<0.05),α-SMA、COL-1的mRNA和蛋白表达水平均明显增加(P<0.01),p-Nrf2、NQO1、HO-1的蛋白表达水平均明显下调(P<0.05)。而与TGF-β1组比较,联合组在24、48、72 h时细胞的增殖能力均明显减弱(P<0.05);α-SMA、COL-1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.01),p-Nrf2、NQO1、HO-1的蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。结论脂氧素A4可抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞的增殖与分化,且该作用可能是通过调节Nrf2通路而实现。