晚期非小细胞肺癌ERCC1和BRCA1的表达及与顺铂耐药性的临床研究

目的:探讨核苷酸切除修复交叉互补组1(excision repair cross complementation group 1,ERCC1)和乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及与顺铂耐药的关系。方法:应用免疫组织化学法检测81例NSCLC患者标本ERCC1和BRCA1蛋白的表达,并与患者年龄、性别、组织病理学类型、临床分期、吸烟指数及含铂化疗方案疗效的关系进行分析。结果:ERCC1蛋白表达阳性率为35.80%,与患者的性别、年龄、临床分期及吸烟指数无关,ERCC1蛋白在腺癌中的表达高于鳞癌,差异有统计学意义(P<0.05);ERCC1表达阳性组的化疗有效率(24.14%)低于阴性组(63.46%),差异有统计学意义(P<0.05);ERCC1表达阳性组的中位生存期(median sur-vival time,MST)(12.1个月)低于阴性组(20.6个月),差异有统计学意义(P<0.05)。BRCA1蛋白表达阳性率为51.85%,与患者的性别、年龄、临床分期、组织学类型及吸烟指数无关;BRCA1表达阳性组化疗有效率(38.10%)低于阴性组(61.54%),差异有统计学意义(P<0.05);BRCA1表达阳性组的MST(15.2个月)与阴性组(16.7个月)比较无明显差异。结论:ERCC1和BRCA1蛋白表达检测可预测NSCLC患者对铂类化疗药物的敏感性,有助于临床上NSCLC个体化化疗方案的制定。

靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的:探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-completion gene 1,ERCC1)逆转耐顺铂(cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性。方法:(1)常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的ERCC1-siRNA转染细胞,转染浓度分别为100、200、300 nmol/L,并设空白转染、Lip转染对照组,观察转染效果。(2)采用免疫组化SABC法及RT-PCR法分别检测肿瘤细胞转染siRNA后ERCC1基因和蛋白的表达。(3)MTT法检测肿瘤细胞耐药指数,观察ERCC1靶向siRNA逆转A549/CDDP细胞顺铂耐药的效果。结果:(1)Lip组、siRNA-neg组转染效率分别为(56.38±9.82)%、(63.54±4.87)%,SiRNA-ERCC1①组、siRNA-ERCC1②组、siRNA-ERCC1③组转染效率分别为(43.62±6.08)%、(65.85±9.61)%和(78.93±4.86)%。(2)针对ERCC1的siRNA转染A549/CDDP后,细胞ERCC1 mRNA及蛋白表达均下调,siRNA-ERCC1(300 nmol/L)组效应最强,分别下降至(11.19±6.82)%和(20.88±6.57)%(P<0.01)。(3)A549/CDDP细胞转染后耐药倍数减为6.05、4.64、2.94,空载体对照组细胞的耐药倍数为9.6。结论:RNA干扰技术封闭ERCC1基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性,且呈一定的浓度依赖性;ERCC1基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点。

顺铂对人肺腺癌细胞作用与ERCC1表达的相关性研究

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达可能与DDP耐药有关。本研究的目的是证实ERCC1表达与DDP作用的关系,推测ERCC1在DDP耐药中的作用。方法选择人肺腺癌细胞A549及其耐DDP细胞株A549/DDP为研究对象,RT-PCR及免疫细胞化学方法检测不同浓度、不同作用时间DDP干预后细胞中ERCC1的表达,采用MTT法检测A549/DDP细胞耐药指数。结果10μmol/LDDP作用12h,A549细胞中ERCC1 mRNA表达开始增高,随着作用时间的延长,ERCC1 mRNA的表达逐渐增高,在72h组ERCC1 mRNA表达最强,为66.69%±5.30%。浓度为5μmol/L的DDP即可刺激A549细胞中ERCC1基因水平上升,而随着DDP浓度的增加,ERCC1 mRNA水平逐渐上升,20μmol/L组达高峰(79.50%±5.46%),为对照组的3.9倍。蛋白表达的增高趋势与mRNA基本平行,但二者幅度不完全一致。与亲本细胞比较,经长期小剂量DDP诱导的耐药株A549/DDP中ERCC1表达明显增高。结论随着小剂量DDP作用时间的延长,A549细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量增加,推测ERCC1可能参与了继发耐药的形成。

肺鳞癌患者ERCC1蛋白表达与顺铂体外药敏相关性的研究

目的探讨肺鳞癌组织切除修复交叉互补基因1(ERCC1)蛋白表达与顺铂体外药敏的关系。方法用ATP-TCA法对42例肺鳞癌患者手术切除的新鲜标本进行顺铂体外药敏检测,并用免疫组织化学检测其ERCC1蛋白表达,比较分析ERCC1表达与顺铂疗效的关系。结果ERCC1阳性表达22例(52.4%),阴性表达20例(47.6%);结合顺铂体外药敏结果得出,阳性表达组顺铂有效为8例(36.7%);阴性表达组有效14例(70%),即ERCC1阴性表达对顺铂的体外疗效明显优于阳性表达组,(P<0.05)。结论ERCC1有望成为以顺铂为治疗基础的肺鳞癌患者的预测指标。

基因工程腺病毒H101逆转A549/DDP细胞对顺铂耐药性的实验研究

背景及目的:耐药性产生是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂。目前尚无一种理想的、可应用于临床的顺铂(DDP)耐药逆转剂。本研究探讨基因工程腺病毒H101对DDP耐药性的逆转作用及其机制。方法:体外利用人肺腺癌细胞株A549的DDP耐药模型A549/DDP,采用MTT法检测H101对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用。用流式细胞仪(FCM)测定细胞多药耐药蛋白1(multidrugresistantprotein1,MRP1)、谷胱甘肽鄄S鄄转移酶(GST)及TOPO鄄Ⅱ蛋白表达量,荧光鄄考马斯亮蓝法检测细胞内GSH含量,原子吸收法测定细胞内铂浓度。结果:A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为14.3。加入H101后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(IC50)由352.4μmol/L降至61.6μmol/L,逆转倍数为5.7倍。FCM检测结果显示,A549/DDP细胞的GST和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均较A549细胞高,而两种细胞内均未检测到MRP1的表达,经H101处理后的A549/DDP细胞胞内GST蛋白和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均明显下降。A549/DDP胞内GSH含量比A549高2倍多;H101感染A549/DDP细胞后,胞内的GSH含量下降,随着H101剂量的增加,胞内GSH含量逐渐下降,达A549细胞内GSH水平。原子吸收法测定细胞内铂含量的结果显示,A549细胞内铂含量是A549/DDP细胞内铂含量的3倍,加入H101后,A549细胞内铂的含量无明显变化,但A549/DDP细胞内铂的含量明显增加。结论:H101能逆转A549/DDP对DDP的耐药性,H101逆转DDP耐药性的机制可能是减少A549/DDP细胞内GSH和TOPOⅡ蛋白的水平,增加了A549/DDP细胞内铂的蓄积。

采用基因芯片技术筛选人小细胞肺癌SH77/CDDP多药耐药相关基因表达谱的研究

目的获得人小细胞肺癌(SCLC)SH77/CDDP多药耐药(MDR)相关基因表达谱,为进一步阐明顺铂(CD-DP)所致SCLCMDR的机制奠定基础。方法在成功建立CDDP诱导的人SCLCMDR细胞系SH77/CDDP的基础上,分别提取SH77/CDDP和其亲代SH77细胞的总RNA,反转录合成双链cDNA,通过反转录合成生物素标记的cRNA探针,片段化处理后分别与AffymetrixGeneChip(人类U133系列芯片(U133A、U133B,共包含3.9万个转录本,其中有3.3万个已知基因,0.6万个未知的cDNA序列表达标签)杂交,杂交信号经扫描等处理并用生物信息学对检测结果进行分析。结果与SH77亲代细胞相比,在SH77/CDDP细胞中有2389个(6.13%)基因表达增高,其中增高1倍以上的有464个(1.19%),增高2倍以上的有89个(0.23%),增高3倍以上的有26个(0.07%),增高4倍以上的有7个(0.02%)。其中差异最显著的36个基因包括ABCC3、HSP70、CYP26B1、CYP4A11、IGF1R、LOX2、CAP2、LRP2BP、AKNA、ELTD1等,上调幅度2.5～5.1倍,根据GeneOntology分类和TreeView分析,这36个基因的功能主要为运输、细胞黏附、信号转导、转录和离子结合等。结论高通量的基因芯片技术筛选出大量CDDP所致SCLCMDR相关基因,对这些耐药相关基因功能的验证有助于揭示CDDP所致人SCLCMDR的发生机制。

ERCC-1在晚期非小细胞肺癌中的表达及其与铂类药物化疗敏感性关系

①目的探讨DNA切除修复基因ERCC-1在晚期非小细胞肺癌中的表达及其与铂类药物化疗敏感性的关系。②方法采用免疫组化S-P法检测61例ⅢB、Ⅳ期非小细胞肺癌患者中DNA切除修复基因ERCC-1的表达情况。所有患者均经铂类为基础的化疗方案化疗。③结果在61例患者中,ERCC-1的表达为37.7%(23/61),与患者性别、年龄及临床分期无关;腺癌的表达明显高于其它病理类型,其表达与以顺铂为基础的化疗耐药有关。化疗耐药组ERCC1的阳性表达率为54.84.%,化疗敏感组的ERCC1的阳性表达率为20%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。ERCC1阳性组平均生存时间为645天,阴性组为500天,用Kaplan-Meier进行单因素的生存分析,其差异无统计学意义(P>0.05)。④结论晚期肺癌存在ERCC1的表达,且与DDP为基础的化疗敏感性相关。检测ERCC-1可以预测晚期肺癌的铂类药物化疗敏感性。

p53调控的肺癌细胞顺铂敏感性相关基因片段的分离和克隆

目的 克隆野生型 p5 3 (wtp5 3 )影响人大细胞肺癌 80 1 D细胞系顺铂敏感性相关基因片段。 方法 采用转基因方法补偿 80 1 D细胞p5 3功能 ,分别提取经IC50 浓度顺铂刺激的转染wtp5 3细胞、空载细胞和未经顺铂作用的转wtp5 3细胞RNA ,用银染mRNA差异显示方法分离差异表达基因 ,反转录点杂交和巢式PCR进行确证。阳性片段进行克隆及序列分析。结果 获得 6条阳性片段 ,2条含有开放阅读框架(ORF) ,其中 1条片段部分与核糖核苷还原酶α链有 5 6%同源性 ,另一片段D1含有一个长ORF ,与已知cDNA序列同源率低。结论 p5 3对 80 1 D细胞顺铂敏感性的影响有明显的基因水平改变 ,可能诱导了相关基因表达。

晚期非小细胞肺癌中切除修复交叉互补基因1的表达及临床意义

目的:探讨非小细胞肺癌组织中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达水平与顺铂化疗耐药及预后的相关性。方法:应用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法检测104例非小细胞肺癌组织中ERCC1的表达并分析其与顺铂化疗耐药及1年生存率的关系。结果:非小细胞肺癌癌组织ERCC1表达水平与非小细胞肺癌患者性别及组织学类型无关,而与非小细胞肺癌患者以顺铂为基础联合化疗的耐药性有关。非小细胞肺癌化疗无效组ERCC1的阳性表达率为69.2%,明显高于化疗有效组12.8%,差异有统计学意义(P<0.05);ERCC1高表达者有较短的中位总生存期(11.0个月)和无进展生存(8.0个月),而ERCC1低表达患者有较长的中位总生存期(16.0个月)和无进展生存(13.0个月)。患者性别、年龄和组织类型与中位总生存期及无进展生存无相关性。结论:ERCC1在非小细胞肺癌组织中的表达水平与顺铂化疗耐药有关,ERCC1的高表达往往提示预后不佳。

沉默Bmi-1表达可逆转肺癌细胞对顺铂的耐药性

目的探讨沉默Bmi-1表达在逆转人肺癌顺铂耐药性的作用及机制。方法以siRNA沉默Bmi-1表达,MTT法检测细胞顺铂敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡,β-半乳糖酐酶染色法检测细胞的衰老,Western blot法检测Bmi-1、P14ARF、P16INK4a、P53、P21、Rb、ubi-H2AK119蛋白表达。结果肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞的Bmi-1表达明显高于A549细胞;沉默Bmi-1的表达显著增加耐药株对顺铂的敏感性(IC50从40.3±4.1μmol/L降到18.3±2.8μmol/L,P<0.01),细胞G0/G1期比值显著升高[从(48.9±2.3)%升到(78.7±7.6)%,P<0.01];细胞β-半乳糖酐酶染色阳性,呈衰老特征。细胞衰老通路的P14ARF、P16INK4a、P53、P21、Rb表达上调,ubi-H2AK119表达下调。结论沉默Bmi-1表达能诱导A549/DDP细胞衰老,逆转对顺铂的耐药性,其作用机制可能与降低ubi-H2AK119表达、调节INK4a/ARF/Rb衰老通路有关。

E2F-1基因沉默对人胃癌耐药细胞株SGC7901／顺铂多药耐药性的逆转

目的探讨E2F一1基因沉默后对人胃癌顺铂（DDP）耐药细胞株SGC7901／DDP多药耐药性的影响及可能的作用机制。方法将人胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP接种于6孔板，并分为以E2F-1基因沉默重组慢病毒颗粒Lv-shRNA—E2F-1感染的SGC7901／DDP细胞（实验组）、以对照慢病毒颗粒Lv-shRNA，NC感染的SGC7901／DDP细胞（阴性对照组）以及常规培养的SGC7901／DDP细胞（空白对照组）。采用Westernblot技术检测各组细胞中E2F-1蛋白的表达，采用四甲基偶氮唑蓝法检测阿霉素、氟尿嘧啶和DDP对各组细胞的半数抑制浓度（IC50），采用流式细胞术检测各组细胞中阿霉素的泵出率和细胞凋亡率，采用半定量RT—PCR和Westernblot技术检测各组细胞中多药耐药基因1（MDRl）、多药耐药相关蛋白（MRP）及凋亡相关基因cyclinD1、c-Myc、Skp2mRNA和蛋白的表达水平。结果实验组、阴性对照组和空白对照组SGC7901／DDP细胞中E2F-1蛋白的相对表达量分别为0．794±0．033、1．487±0．082和1．5114-0．084，实验组SGC7901／DDP细胞中E2F-1蛋白的相对表达量较阴性对照组和空白对照组分别下降46．6％和47．5％（P〈0．01）。阿霉素、氟尿嘧啶和DDP对实验组SGC7901／DDP细胞的Ic50均较阴性对照组和空白对照组明显降低（均P〈0．01）。实验组、阴性对照组和空白对照组SGC7901／DDP细胞中阿霉素的泵出率分别为（0．16±0．01）％、（0．37±0．01）％和（0．35±0．02）％，实验组SGC7901／DDP细胞中阿霉素的泵出率明显低于阴性对照组和窄白对照组（P〈0．01）。实验组、阴性对照组和空白对照组SGC7901／DDP细胞的凋亡率分别为（33．82±1．26）％、（17．34±0．81）％和（13．164-1．06）％，实验组SGC7901／DDP细胞的凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组（P〈0．01）。与阴性对照组和空白对照组比较，实验组SGC7901／DDP细胞中MDRl、MRP、cyclinD1pMyc和skp2mRNA及蛋白的表达水平均明显降低（均P〈0．01）。结论沉默E2F-1基因的表达可有效提高人胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP对化疗药物的敏感性，并可直接或间接下调经典多药耐药相关基因MDRl和MRP的表达，从而逆转胃癌细胞的多药耐药性，其机制可能与cyclinD1、c—Myc和Skp2的表达下调有关。

SiRNA干扰结肠癌转移相关基因1表达对卵巢癌顺铂化疗耐药性的影响

目的:利用RNA干扰技术抑制结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)在顺铂(cisplatin,DDP)耐药的卵巢癌细胞株SKOV-3/DDP中的表达,并探讨其对DDP化疗耐药性的影响。方法:RNA干扰分为3组,空白对照组为未经处理的SKOV-3/DDP细胞,阴性对照组为空质粒转染的SKOV-3/DDP-shVector细胞,实验组为MACC1-shRNA重组质粒转染的SKOV-3/DDP-shMACC1细胞。反转录PCR法和蛋白质印迹法检测稳定转染后SKOV-3/DDP细胞中MACC1 mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞对DDP的耐药性变化,FCM法检测细胞凋亡变化。结果:相比于未转染组SKOV-3/DDP细胞,MACC1-shRNA转染组SKOV-3/DDP-shMACC1细胞中MACC1的mRNA及蛋白水平均明显下调[下调百分率分别为(83.39±1.26)%和(82.25±2.94)%,P<0.05]。DDP对SKOV-3/DDP-shMACC1细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))值与未转染组和空质粒转染组细胞的IC_(50)值比较,均明显降低[(26.09±0.91)μmol/L vs(47.50±0.40)μmol/L和(47.08±0.45)μmol/L,P<0.05]。SKOV-3/DDP-shMACC1细胞凋亡率明显提高[(13.77±0.60)%vs(3.63±0.30)%和(4.23±0.30)%,P<0.05]。结论:RNA干扰抑制MACC1基因表达能增强卵巢癌耐药细胞SKOV-3/DDP对DDP的敏感性。

顺铂耐药相关基因的筛选、验证及生物信息学分析

目的筛选并验证卵巢上皮癌和肺腺癌顺铂耐药的共同差异基因并进行生物信息学分析。方法从基因表达数据库GEO中下载卵巢上皮癌和肺腺癌顺铂耐药芯片数据GSE33482和GSE108214,用R语言软件筛选差异基因并分析得到共同差异基因。运用Metascape进行富集,运用STRING构建蛋白互作网络并使用Cytoscape筛选关键基因。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证关键基因的mRNA表达水平。运用Kaplan-Meier Plotter绘制关键基因的生存曲线。结果筛选得到295个表达上调和176个表达下调的共同差异基因。共同差异基因主要富集于细胞损伤修复、辅助性T淋巴细胞17(Th17)细胞分化、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)信号通路、细胞黏附、轴突导向和细胞因子间受体相互作用。蛋白互作网络筛选得到10个关键差异基因,qRT-PCR结果显示除HSPB1外其余9个关键基因表达情况与芯片结果一致。生存曲线显示GNG4和PRKCA基因的高表达导致卵巢癌和肺腺癌患者的生存率均明显降低。结论GNG4和PRKCA基因的表达与卵巢上皮癌及肺腺癌细胞顺铂耐药及患者的总生存率均密切相关,有望成为逆转顺铂耐药和改善患者预后的生物学新靶标。

矿物粉尘诱导基因对肺癌细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨矿物粉尘诱导基因(mdig)对肺癌细胞顺铂(DDP)敏感性的影响。方法运用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测A549细胞和DDP耐药的A549细胞(A549/DDP)中mdig mRNA和蛋白的表达水平,进一步分别沉默和过表达A549细胞中的mdig,然后采用CCK-8法检测经不同浓度DDP处理的各组细胞的增殖情况,进而评价其对DDP的药物敏感性变化,并计算DDP的半数抑制浓度(IC50)。结果A549/DDP细胞mdig mRNA和蛋白的表达分别明显高于A549细胞(t=4.8、9.7,P值均<0.01),而且A549/DDP细胞的IC50值明显高于A549细胞[(93.8±8.7)mg/L比(29.9±1.4)mg/L,t=12.6,P<0.01],耐药系数为3.14;A549细胞mdig过表达后,其DDP的IC50值明显增高[LV-mdig组比Vector组为(176.9±13.4)mg/L比(37.6±2.0)mg/L,F=309.0,P<0.01],而mdig沉默后,其IC50值明显降低[LV-mdig RNAi组比LV-con组为(10.8±1.4)mg/L比(26.7±1.1)mg/L,F=146.7,P<0.01]。结论mdig能够降低肺癌细胞对DDP的敏感性,从而导致对DDP的耐药。